1、液相色谱培训讲义北京东西分析仪器有限公司主要内容 高效液相色谱的基础知识 高效液相色谱系统 固定相和流动相 LC-5500的使用、维护及应用 液相色谱分析中的样品前处理高效液相色谱的基础知识液相色谱培训（一）色谱色谱法 又叫色层法、层析法，其本质是一种分离分析方法 色谱法是利用混合物中各组分在两相间分布系数的差异，在两相相对移动过程中，各物质在两相间反复多次分配，从而使各组分得到分离的方法色谱 目前最有效的分离方法色谱的分类按流动相的物态分:气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流
2、动相(又叫洗脱剂)液相色谱发展简史 1903年：俄国植物学家Tswett提出了应用吸附学原理分离植物色素的新方法，标志这现代色谱学的开始 1931年：Kuhn等以粉碎的碳酸钙装填色谱柱，成功地从蛋黄中分离出植物叶黄素，也证实了色谱法可以用于制备分离 1941年：Martin等采用水分饱和的硅胶为固定相，以含乙醇的氯仿为流动相，分离了乙酰基氨基酸，这是分配色谱的首次应用 20世纪60年代：高效液相色谱得到普及应用 1975年：美国Dow Chemical公司Small等研制成功了采用电导检测器的高效液相色谱仪，这种方法称为离子色谱法（IC），扩展了高效液相色谱的领域。近年来：超高压液相色谱（UP
3、LC）问世，使得液相色谱应用领域更加广泛绿色两种叶绿素黄色三种叶绿素脱脂棉填料纯石油醚茨维特实验的原形茨维特实验的原形1903年Tswett用右边图示的实验装置，使用液体淋洗的办法实现了多种物质的分离从而确立了色谱分析法。从此这个实验方法就成为：经典液相色谱法经典液相色谱法 时至今日这种方法还被广泛地应用着随着科学技术的发展，科学工作者改进了液相色谱柱的填料，从而就出现了高效液相色谱分析。几种英文缩写的解释：HPLCHigh Performance Liquid ChromatographyHPLCHigh Pressure Liquid Chromatography高效液相色谱 HPLC(H
4、igh Performance Liquid Chromatography)以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：o高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器 广泛应用于各个领域:o医药，环保，石化，生命科学，食品工业，农业HPLC的分离原理 高效液相色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。流流动动相
5、相色谱分离样品的过程HPLC的特点“三高”“一快”“一广”相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别分析对象分析对象 GC：可分析能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 HPLC：可分析溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性 和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性 差及高分子和离子型样品均可检测流动相流动相 GC：流动相为气体 HPLC：流动相为液体 经典LCHPLC色谱柱：柱长10200cm，内径1050mm色谱柱：柱长1025cm，内径210mm常压或减压高压，4050MPa填料颗粒大，75600m（20030目）填料颗粒小，250m（250030
6、0目）柱效低，2050块/m柱效高，4000060000块/m分析速度慢，120h分析速度快，0.051.0h色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测基本概念和术语基本概念和术语色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基线信号的波动。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流
7、出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。检检测测器器响响应应保留时间和峰形保留时间和峰形检检测测器器响响应应保留时间和峰形保留时间和峰形检检测测器器响响应应保留时间和峰形保留时间和峰形色谱图色谱图基底基线色谱峰峰面积峰高拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰
8、。峰底基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线x1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与峰底的两个交点间的距离。W4半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/22.355峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。基本概
9、念和术语基本概念和术语基本概念和术语基本概念和术语定性参数（保留值）死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流通池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流通池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速）保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出
10、现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR柱效参数柱效参数理论塔板数(theoretical plate number，N)-用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N
11、越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间(tR)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。理论塔板高度(theoretical plate height，H)-每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。基本概念和术语基本概念和术语22/254.516 hRRWtWtNNLH 22/254.516 hRRWtWtN有效有效基本概念和术语基本概念和术语相平衡参数相平衡参数分配系数(distribution coefficient，K)-在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固
12、定相与流动相中的浓度之比。即，K=Cs/Cm 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定
13、时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。基本概念和术语基本概念和术语容量因子(capacity factor，k)-化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间
14、（tR）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，tR 0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。选择性因子(selectivity factor，)-相邻两组分的分配系数或容量因子之比。又称为相对保留时间（美国药典）。要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情
15、况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。基本概念和术语基本概念和术语分离参数分离度(resolution，R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1W2时，R1。当R1时，称为4分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R1.5时，称为6分离，裸露峰面积为99.7%。R1.5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，R0，无论柱
16、效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k在110范围内，最好为25，窄径柱可更小些。R=1R=1.5色谱分离的理论色谱分离的理论 色谱理论有平衡色谱理论；塔色谱理论有平衡色谱理论；塔板理论；速率理论等理论。下面对塔板理论；速率理论等理论。下面对塔板理论和速率理论作简单的介绍。板理论和速率理论作简单的介绍。塔板理论塔
17、板理论(Tower plank Theories)塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但
18、是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。理论塔板数理论塔板数 22/254.516 hRRWtWtN色谱柱效能色谱柱效能 描述当溶质流经色谱柱时谱带展宽速率描述当溶质流经色谱柱时谱带展宽速率理论塔板等效高度理论塔板等效高度NLH 有效理论塔板数有效理论塔板数22/254.516 hRRWtWtN有效有效塔板理论塔板理论(Tower plank Theories)速率理论速率理论(Velocity Theories)1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动
19、力学理论速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响 速率理论速率理论(Velocity Theories)H=A+B/u+Cgu+CluHuB/uCuAu最佳最佳A涡流扩散项B分子扩散项Cg固定相传质阻抗Cl流动相传质阻抗高效液相色谱的分类高效液相色谱的分类按色谱过程的分离机制，可将高效液相色谱分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱和体积排阻色谱等类别根据流动相与固定相极性的差别，可分为正相色谱和反相色谱两种模式。固定相极性大于流动相极性时，称为正相色谱（NP）；反之，称为反相色谱（RP）正相高效液相色谱 以极性的亲水性填料作固定相（
20、如羟基柱、氨基柱、氰基柱），以非极性的疏水性溶剂或混合物作流动相（如己烷）的高效液相色谱 正相高效液相色谱的流动相：常用己烷，环己烷作基础溶剂，加二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃调节极性 应用于分离中等极性和极性较强的化合物，如甾醇类、类脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其它有机物反相高效液相色谱 以强疏水性的填料作固定相（如硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相），以可以和水混溶的有机溶剂做流动相（如甲醇、乙腈）的高效液相色谱 反相高效液相色谱的流动相：高纯度的水，甲醇，乙腈，一定pH值的缓冲液 应用十分广泛，占高效液相色谱的70%80%，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子
21、量不大的蛋白质（50kD）的分析均可应用高效液相色谱流程图高效液相色谱流程图高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱储液瓶色谱分离样品的过程色 谱 柱检测器色 谱 图时刻A时刻B时刻C时刻D时刻E时刻F进样色谱图的作用 说明样品中的组分数说明样品中的组分数 根据保留时间值定性根据保留时间值定性 根据峰面积（峰高）定量根据峰面积（峰高）定量 评价柱效及分离情况评价柱效及分离情况定性和定量方法定性和定量方法死时间t0，保留时间tR峰高h，峰面积A基线峰底色谱峰峰高峰面积利用保留值定性在液相色谱中，组分的保留行为不仅与固定相有关，还与流动相的种类、组成有关在液相色谱中主要是用与已知物对照的方法定性，改变条
22、件进一步判断利用文献数据只能作为参考利用三维图谱进行定性，可靠性大大增加用保留时间定性的谱图对比三聚氰胺标样蛋白粉样品定量方法峰高和峰面积法定量，主要有四种定量方法 归一化法 内标法 外标法-标准曲线法 内加法外标法液相最常用的定量方法峰高法和峰面积法的选择 主要决定于检测器的线性范围、峰高和峰面积测量的准确性和重复性。归一化法最好用峰面积法，其余方法峰高和峰面积都可使用 分离度较好，色谱峰形较好，峰面积可以准确测量时，用峰面积定量为好，特别是HPLC使用多元梯度时，最好用峰面积定量 分离度不好、色谱峰形不好时，用峰高法为好 保留时间短的用峰高法，长的用峰面积法高效液相色谱系统液相色谱培训（二
23、）高效液相色谱流程图高效液相色谱流程图高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱储液瓶一个存放流动相的容器。其结构材料必须对流动相是化学惰性的，常用的溶剂储液瓶的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料、特种塑料聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯衬里不锈钢容器等，贮液罐容积一般为0.52 L 储液瓶储液瓶输液系统功能：输液系统功能：溶剂输送溶剂输送目标：目标：稳定稳定准确准确重要指标：重要指标：耐压能力耐压能力压力脉动压力脉动流量精密度流量精密度流量准确性流量准确性高压输液泵柱柱双柱塞往复式并联泵双柱塞往复式并联泵柱柱双柱塞往复式串联泵双柱塞往复式串联泵进样器 自动进样器和手动进样器 原理：六通阀手动进样
24、器六通阀 一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。耐高压（3540MPa），进样量准确，重复性好，操作方便 分离系统分离系统功能：功能：组分分离组分分离目标：目标：分辨力强分辨力强效率高效率高色谱柱液相色谱柱液相色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，是分析好坏、成败的关键键合相色谱柱 键合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;苯基柱 5%,正相:20%;硅胶、-NH2、-CN、-OH 其它(手性柱,离子交换柱):10%反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。C18 和 C8
25、在反相色谱中应用得最为广泛。检测器检测器功能功能：检测组分浓度检测组分浓度目标：目标：准确准确检出限检出限低低重要指标：重要指标：噪声、漂移、线性、检出限噪声、漂移、线性、检出限 紫外检测器（包括二极紫外检测器（包括二极管阵列检测器）管阵列检测器）荧光检测器荧光检测器 示差折光检测器示差折光检测器 电导检测器电导检测器 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器v原理：基于被分析组分对特定波长紫外光原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收的选择性吸收v定量基础：朗伯定量基础：朗伯-比耳定律，比耳定律，ACLv优点：优点：1）灵敏度高）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感）对温度和流速不敏感 3）可用
26、于梯度洗提）可用于梯度洗提v缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质 样品池样品池二极管阵列二极管阵列光栅光栅D2/W 灯灯每一组分可在每一波每一组分可在每一波长处得到一吸光度值长处得到一吸光度值二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器1）采集三维谱图）采集三维谱图2）峰纯度检验）峰纯度检验3）光谱库检索）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰）可以发现单波长检测时未测到的峰大多数有机化合物有一定程度的吸光度，所以大多数有机化合物有一定程度的吸光度，所以紫紫外外-可见检测器可见检测器可以测定大多数的化合物，是目可以测定大多数的化合物，是
27、目前实验室中使用最多的检测器前实验室中使用最多的检测器 -多数公司售出的检测器中多数公司售出的检测器中75%以上是吸以上是吸光度检测器（其中光度检测器（其中50%以上是紫外以上是紫外-可见检可见检测器，测器，25%是是PDA）紫外-可见检测器v原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。样中各组分浓度。v优点：通用型检测器，优点：通用型检测器，v缺点：缺点：1）对温度变化敏感）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3）属于中等灵敏度的检测器）属于中等灵敏度的检测器v原理：根据物质在某些介质
28、中电离后所产生的原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法子色谱法v优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱用于梯度洗脱v缺点：对温度变化敏感（每升高缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率度，电导率增加增加2%-2.5%)v主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子蒸发激光光散射检测器（ELSD）通用型检测器（适合通用型检测器（适合于挥发性比流动相低于挥发性比流动相低的任何组分）；响应的任何组分）；响应值与组分质量有关
29、；值与组分质量有关；可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱HPLC柱柱喷雾气体喷雾气体蒸发漂移管蒸发漂移管激光光源激光光源样品液滴样品液滴光二极管检测器光二极管检测器散射室散射室工作站数据采集系统数据采集系统功能功能：采集处理数据采集处理数据目标：目标：使用便捷使用便捷功能完善功能完善梯度洗脱HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式 等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品 比例阀检测器进样器ABCD
30、色谱柱色谱柱高压输液泵低压梯度 阻尼器 混合器高压输液泵检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器高压输液泵高压梯度梯度洗脱 优点 缩短分析时间 增加分离能力 提高检测灵敏度 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI)柱需再生平衡 定量分析的重复性较低高效液相色谱的配件 管路与连接件 脱气装置：在线脱气机或超声波清洗器 过滤器：溶剂过滤器和针筒式过滤器 进样器：平头进样器不同材质的管路 不锈钢管：耐腐蚀性好，有精密的同轴度，一般用于高压部分 聚合物管：用在液相色谱系统中从储液瓶到泵、检测器出口以后和进样器排液口等低压部分 PEEK（聚醚醚酮）管：是一种耐高温、高性能的工程塑料，具有良好的惰性，适
31、宜于生物样品的分离分析液路连接件 连接件也称接头 一般可分为两种：高压接头和低压接头 高压接头采用不锈钢材质 低压接头采用高聚物材质 连接件主要有卡套和空心螺钉液路连接密封示意图 液路连接装配不合适的示意图脱气装置超声波清洗器 通过超声波作用使流动相中的气泡排除，超声脱气效率只有2030左右在线脱气机 脱气效果好，脱气效率大于70，在线脱气机使用方便、省事，尤其是在作梯度洗脱时最好用在线脱气机。过滤装置溶剂过滤器 为了除去流动相中的杂质，对流动相进行过滤 溶剂过滤器要配滤膜（有机系和水系，规格0.45m或更小孔径的滤膜）针筒式过滤器 样品溶液在进入色谱系统前必须经过针筒式过滤器 针筒式过滤器也
32、分为有机系和水系，规格0.45m或更小孔径的进样器 液相色谱的进样器必须是平头进样器 常配的进样器规格为10、25、50、100 L 最常使用的为50 L的进样器LC-5500和LC-5510高效液相色谱仪介绍LC-5500高效液相色谱仪LC-5500高压输液泵 P-101型高压液相平流泵由泵体、过滤器、缓冲器、步进电机、步进电机驱动器、控制电路板、键盘以及液晶显示器等部件构成 LC-5500高压输液泵技术指标技术指标1 压力脉动：1LC-5500高压输液泵主要特点主要特点 采用双柱塞交替输液吸液，特殊设计的非圆凸轮运动曲线，保证输出液体流速稳定 精密电机及电路设计，实现流量控制和流速的稳定性
33、 压力传感器避免了过压对色谱柱和泵的意外损害 性能良好的阻尼器有效消除了输液脉冲 采用LCD带背光的显示屏来显示泵的设置参数和运行参数。梯度洗脱流量程序智能化，流量准确LC-5500高效液相色谱仪主机主机包括两部分：主机包括两部分：LC-5500柱温箱技术指标：技术指标：温度控制范围：室温1080 温度控制精度：1功能特点：功能特点：控温精度准确 更换色谱柱方便 分析结果重现性好 保证检测稳定性LC-5500紫外-可见光检测器技术指标：技术指标：波长范围：190650nm 波长精度:2nm 波长重复性:优于2nm 基线噪声：110-4AU 基线漂移：510-4AU/h 光谱带宽：8nm 流通池
34、体积：5ul 最小检测浓度：410-8g/mL(萘的甲醇溶液)LC-5500紫外-可见光检测器功能特点：功能特点：使用波长范围宽 波长精度准确 能够实现多波长测定LC-5500工作站功能特点：功能特点：具有仪器控制系统、数据采集和处理系统；可进行波长程序控制 可设定柱温 可对两台泵进行程序控制，进行梯度洗脱 LC-5510高效液相色谱仪LC-5510 在线脱气机 在线脱气机主要由真空泵、脱气膜管、传感器、控制电路、真空腔等组成 在线脱气机的主要目的是脱除流动相中的气泡LC-5510高压输液泵技术指标技术指标1 压力脉动：1LC-5100高压输液泵主要特点主要特点 采用双柱塞交替输液吸液，特殊设
35、计的非圆凸轮运动曲线，保证输出液体流速稳定 精密电机及电路设计，实现流量控制和流速的稳定性 压力传感器避免了过压对色谱柱和泵的意外损害 性能良好的阻尼器有效消除了输液脉冲 采用LCD带背光的显示屏来显示泵的设置参数和运行参数。梯度洗脱流量程序智能化，流量准确LC-5510柱温箱技术指标：技术指标：温度控制范围：580 温度控制精度：0.2 温度设定值误差：0.5LC-5510柱温箱功能特点：控温精度准确 分析结果重现性好 保证检测稳定性 采用LCD带背光的显示屏来显示柱温的设置和运行温度 既可升温也可降温，能满足一些特殊用户的需求LC-5510紫外-可见光检测器技术指标：波长范围：190650
36、nm 波长精度:0.2nm 波长重复性:优于0.2nm 基线噪声：610-5AU（动态，254nm）基线漂移：2.510-4AU/h（动态，254nm）光谱带宽：8nm 流通池体积：5ul 最小检测浓度：110-8g/mL(萘的甲醇溶液)LC-5510紫外-可见光检测器功能特点：使用波长范围宽 波长精度高 噪声低漂移小 可用汞灯自动校正波长 采用LCD带背光的显示屏来显示波长的设置参数和运行参数LC-5510工作站功能特点：具有色谱仪控制系统、数据采集和处理系统；可进行波长程序控制 可对两台泵进行程序控制，进行梯度洗脱 功能健全，操作便捷 固定相和流动相液相色谱培训（三）色谱柱 色谱柱是高效液
37、相色谱仪的核心部分，要色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，要求分离度高，柱容量大，分析速度快。高求分离度高，柱容量大，分析速度快。高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、填装和使用技术等有关。填装和使用技术等有关。液相色谱柱是分液相色谱柱是分析好坏、成败的关键，整个液相分析过程析好坏、成败的关键，整个液相分析过程中，其作用的重要性犹如人的心脏中，其作用的重要性犹如人的心脏色谱柱的分类 按填料表面改性与否分为吸附型和化学键合型 按照分离模式分为正相、反相、离子交换、疏水作用、体积排组、亲和、手性等类型 按照分离规模及色谱柱的几何尺寸，可分为制备柱、分析柱、微型
38、柱等类型色谱柱结构色谱柱的基质填料 硅胶基质填料 聚合物基质填料硅胶基质填料1.目前应用最为广泛的基质填料2.高机械强度和高的比表面积3.可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求4.重现性好5.pH 适用范围为pH 286.具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基聚合物基质填料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH 稳定性好：pH 113可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩分
39、离效率相对硅胶而言比较低重现性不好化学键合固定相 将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相 化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性 由化学键合固定相制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，并可用于梯度洗脱操作 类 型性 质色谱分离方式应 用 范 围烷基非极性反相、离子对中等极性化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷酸、极性合成药物等苯基非极性反相、离子对非极性至中等极性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶
40、性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生花氨基酸酚基弱极性反相中等极性化合物，保留极性相似于C8固定相，但对多环芳烃、极性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的选择性醚基弱极性反相或正相醚基具有斥电子基团，适用于分离酚类、芳硝基化合物，其保留行为比C18更强（k增大）二醇基弱极性正相或反相二醇基团比未改性的硅胶具有更弱的极性，易用水润湿，适于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离肽、蛋白质的凝胶过滤色谱固定相芳硝基弱极性正相或反相分离具有双键的化合物，如芳香族化合物多环芳烃 腈基极性正相（反相）正相相似于硅胶吸附剂，为氢键接受体，适于分析极性化合物，溶质保留值比硅胶柱低，反相可提供与C8、C18，苯基
41、柱不同的选择性胺基极性正相（反相、阴离子交换正相可分离极性化合物，如芳胺取代物，脂类，甾类化合物，氯代农药；反相分离单糖、双糖等碳水化合物；阴离子交换可分离酚、有机羧酸和核苷酸二甲胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离弱有机酸 二胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离有机酸 化学键合固定相的类型及其应用范围化学键合固定相的类型及其应用范围类 型性 质色谱分离方式应 用 范 围烷基非极性反相、离子对中等极性化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷酸、极性合成药物等苯基非极性反相、离子对非极性至中等
42、极性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生化氨基酸酚基弱极性反相中等极性化合物，保留极性相似于C8固定相，但对多环芳烃、极性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的选择性醚基弱极性反相或正相醚基具有斥电子基团，适用于分离酚类、芳硝基化合物，其保留行为比C18更强（k增大）二醇基弱极性正相或反相二醇基团比未改性的硅胶具有更弱的极性，易用水润湿，适于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离肽、蛋白质的凝胶过滤色谱固定相芳硝基弱极性正相或反相分离具有双键的化合物，如芳香族化合物多环芳烃 腈基极性正相（反相）正相相似于硅胶吸附剂，为氢键接受体，适于
43、分析极性化合物，溶质保留值比硅胶柱低，反相可提供与C8、C18，苯基柱不同的选择性胺基极性正相（反相、阴离子交换正相可分离极性化合物，如芳胺取代物，脂类，甾类化合物，氯代农药；反相分离单糖、双糖等碳水化合物；阴离子交换可分离酚、有机羧酸和核苷酸二甲胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离弱有机酸 二胺基极性正相、阴离子交换正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离有机酸 使用键合固定相应注意的问题使用键合固定相应注意的问题（1）硅胶键合相的稳定性 键合相的使用寿命取决于键合的有机官能团在硅胶表面的覆盖程度，覆盖量大或呈多分子 覆盖层时会增加其稳定性。通常正相键合相
44、的稳定性要低于反相键合相反相烷基键合相的 稳定性与使用流动相的pH值有关，通常水溶液的pH应保持在28之间，pH8.5会引起基 体硅胶的溶解。（2）键合相色谱分离的重现性 使用键合相时经常会遇到，同一类型的键合相，因生产厂家不同，或生产批号不同，而表 现出不同的色谱分离特性，为此应在实验室中准备一定数量相同批号的键合固定相（或色 谱柱），以保证分析结果有良好的重现性。（3）键合相色谱分离的选择性 在反相色谱分析中，使用同一种ODS固定相，并用两种极性参数值相近，但由不同溶剂 组成的流动相时，会由于“溶剂诱导选择性的变化”而获得不同的结果。（4）键合相的再生 使用键合相色谱柱时，由于大量极性或非
45、极性样品的连续注入，会引起固定相对样品的吸 附、缔合等不良效应，而使柱分离性能变差，引起峰形变宽或拖尾等现像此时应及时对色 谱柱进行再生处理。对正相键合相柱可用1 1甲醇氯仿流动相来进行再生；对反相键合 相柱可用甲醇流动相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或约0.01mol/L无机酸水 溶液进行再生。正相色谱固定相 最常用的正相色谱固定相硅胶 最常用的极性键合固定相氰基（CN）、氨基（NH2）等反相色谱固定相 大多数是各种烃基硅烷的键合硅胶：如C2、C4、C6、C8、C16、C18和C22等 最常用的是C18，又称ODS，即十八烷基硅烷键合硅胶测柱效-良好的色谱实验习惯 记住拿到一根从未
46、用过的色谱柱时记住拿到一根从未用过的色谱柱时 一定要先看其使用说明！一定要先看其使用说明！评价色谱柱好坏的标准 1）理论塔板数N 2）拖尾因子Tf 3）色谱柱背压 4）pH值的适用范围 5）使用寿命理论塔板数 N粒径(m)柱长(cm)塔 板 数 N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,000拖尾因子TfAs=1.0-1.05 很 好As=1.2 一 般As=2 差A
47、s=4 很差不对称因子和拖尾因子的关系As(at 10%)Tf(at 5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子(As)=BA A拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高色 谱 柱 背 压1.粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。2.色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30。3.硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。4.色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P=3000Lt0dp2P 是色谱柱背压(psi)，L 是色谱柱的长度(cm),流动相的粘度(cP)，t0 是色谱柱死时间,dp 是粒子的直径(m)常用色谱柱的
48、典型流速色谱柱的保护柱柱心柱套1.在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同样，长时间未用的分析柱也要同样 处理处理2.定期使用强溶剂冲洗柱子定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用含低浓度有机溶剂的水溶液、使用缓冲盐时，要先用含低浓度有机溶剂的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品、净化样品5、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯6、使用预柱、使用预柱7、避免流动相组成及极性的剧烈变化、避免流动相组成及极性的剧烈
49、变化8、避免压力脉冲的剧烈变化、避免压力脉冲的剧烈变化分分 析析 柱柱 的的 维维 护护色谱柱常见毛病 柱压过高 多少才算高?不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低柱压过高 为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长柱效低 为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适
50、造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰“不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附流动相选择的一般要求 化学稳定性好，不与固定相和样品组分发生化学反应 与所用检测器相匹配，不影响检测器的正常工作 对分析样品要有足够的溶解能力，以利于提高检测器的灵敏度 流动相的黏度要小，以保证合适的柱压降 无毒或低毒，易于操作 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境正相色谱流动相 常用流动相为烷烃：戊烷、己烷等 通过填加二氯甲烷、短链醇、四氢 呋喃等极性较大的溶剂来调节流动 相的极性 正相色谱最常用的流动相洗脱强度：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇反相色谱流动相通常以水作为基础
