1、实验八实验八 玻璃器皿的清洗包扎，玻璃器皿的清洗包扎，培养基的配制及灭菌培养基的配制及灭菌一、目的要求一、目的要求 o1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培养皿的包扎方法；和培养皿的包扎方法；o2、掌握培养基的制备原理和方法；、掌握培养基的制备原理和方法；o3、掌握干燥灭菌、湿热灭菌的原理和方法。、掌握干燥灭菌、湿热灭菌的原理和方法。二、基本原理二、基本原理（一）实验室中使用的玻璃器皿简介（一）实验室中使用的玻璃器皿简介 微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量
2、、洗涤和包装方法均有一定的要求。来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的质量一般要求玻璃器皿的质量一般要求硬质玻璃硬质玻璃，才能承受高温和短暂灼烧而，才能承受高温和短暂灼烧而不致破坏；玻璃器皿的不致破坏；玻璃器皿的游离碱含量要少游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的碱度；对玻璃器皿的性状和包装方法的要求性状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌，以能防止污染杂菌为准；为准；洗涤洗涤玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。目前微生玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。目前微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被物学实验室中
3、，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性一次性塑料制品塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。o清洗清洗o包装包装o灭菌灭菌洗涤剂、试管刷等洗涤剂、试管刷等报纸、牛皮纸、专用塑料袋或器皿等报纸、牛皮纸、专用塑料袋或器皿等干热灭菌干热灭菌 湿热灭菌湿热灭菌 紫外灭菌紫外灭菌 过滤过滤玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗器皿包扎器皿包扎二、基本原理二、基本原理（二）培养基简介（二）培养基简介 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各代谢产物的营养基质，用以培养、分
4、离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。按成分：按成分：天然培养基、合成培养基和半合成培养基；天然培养基、合成培养基和半合成培养基；按物理性质：按物理性质：固体培养基、半固体培养基和液体培养基；固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按用途：按用途：基础培养基、鉴别培养基和选择培养基等。基础培养基、鉴别培养基和选择培养基等。培养基的成分和培养基的成分和pH 不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳
5、源、氮不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。不同微生物对源、无机盐和生长因子等。不同微生物对pH要求不一要求不一样，霉菌和酵母的培养基的样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细一般是偏酸性的，而细菌和放线菌培养基的菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。调到合适的范围。配制培养基配制培养基的原则是什的原则是什么？么？根据菌种与用途而选择和配制培养基。根据菌种
6、与用途而选择和配制培养基。常用培养基的配制见实验书附录常用培养基的配制见实验书附录 P241 o实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法、实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法、紫外线照射法和微孔滤膜法等。紫外线照射法和微孔滤膜法等。o干热灭菌和高压蒸汽灭菌是利用高温使微生物细胞内的干热灭菌和高压蒸汽灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。o紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和形成和DNA链的交联，从而抑制了链的交联，从而抑制了DNA的复制。的复制。o过滤除
7、菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。（三）灭菌的常用方法和基本原理（三）灭菌的常用方法和基本原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于
8、器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200300nm的紫外的紫外线都有杀菌能力，其中以线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了的形成，从而抑制了DNA的复制。另一的复制。另
9、一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使，再使O2氧化生成臭氧氧化生成臭氧（O3）或使水（）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（）氧化生成过氧化氢（H2O2），），O3和和H2O2均有均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过。紫外线灯距照射物以不超过12m为为宜。宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒以前，
10、可在无菌室内（或接种箱内）喷洒35的石的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面，凳另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面，凳子可用子可用23的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。结合理论知识结合理论知识和生活，在使和生活，在使用紫外灭菌时用紫外灭菌时你应该注意什你应该注意什么？么？灭菌在微生物实验操作中的重要意义灭菌在微生物实验操作中的重要意义 在微生物实验中，需要进行在微生物实验中，需要
11、进行纯培养纯培养，不能有任何，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的行严格的消毒和灭菌消毒和灭菌。消毒与灭菌不仅是从事微生物学。消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。均具有重要的应用价值。？区别？区别？消毒消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌灭菌则是指杀灭一切
12、微生物的营养体，包括芽孢和孢子。则是指杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子。三、实验器材三、实验器材 o溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、可溶性淀粉、可溶性淀粉、KNOKNO3 3、K K2 2HPOHPO4 43H3H2 2O O、MgSOMgSO4 47H7H2 2O O、FeSOFeSO4 47H7H2 2O O、KHKH2 2POPO4 4、葡萄糖、孟加拉红（、葡萄糖、孟加拉红（1%1%的水溶液）、链霉素的水溶液）、链霉素（1%1%的水溶液）、的水溶液）、1mol/L NaOH1mol/L NaOH、1mol/L HCl1mol/L HCl。o
13、仪器和其他用品：试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃仪器和其他用品：试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、棒、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pHpH试纸（试纸（pH5.5pH5.59.09.0）、棉花、牛皮纸（或铝箔）、）、棉花、牛皮纸（或铝箔）、记号笔、麻绳和纱布等。记号笔、麻绳和纱布等。四、操作步骤四、操作步骤（以配制乳糖蛋白胨液体培养基为例）（以配制乳糖蛋白胨液体培养基为例）实验教材实验教材P246第一件事？第一件事？计算计算蛋白质蛋白质 10g牛肉膏牛肉膏 3g乳糖乳糖 5gNaCl 5g1.6%溴甲酚紫溴甲酚紫 1 ml蒸馏水蒸馏水
14、 1000 ml 6g1.8g3g3g0.6 ml200200 ml ml3 50ml 2支支 5ml 10支支1 5ml 4支支共共 3 3 150ml 150ml 1 1 40ml 40ml可先配制可先配制200ml 3200ml 3 ，分装后，稀释到，分装后，稀释到1 1，再进行分装。再进行分装。四、操作步骤四、操作步骤（以配制乳糖蛋白胨液体培养基为例）（以配制乳糖蛋白胨液体培养基为例）实验教材实验教材P2461 1、称量：、称量：2 2、熔化：、熔化：3 3、按比例加、按比例加1.6%1.6%溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶液 4 4、调、调pHpH：5 5、分装：、分装：6 6、加塞：
15、、加塞：7 7、包扎：、包扎：8 8、灭菌：、灭菌：9 9、无菌检查：、无菌检查：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、乳按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、乳糖、糖、NaCl放入烧杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在放入烧杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯。也可小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。）牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。）在上述烧杯中先加入在上述烧杯中先加入少于少
16、于所需要的水量，用玻璃棒搅所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。药品完全溶解后，补充水到所需的总器上加热溶解。药品完全溶解后，补充水到所需的总体积；体积；在未调在未调pH之前，先用精密之前，先用精密pH试纸测量培养基的原始试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中滴加入如果偏酸，用滴管向培养基中滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用边加边搅拌，并随时用pH试纸测其试纸测其pH，直至，直至pH达到达到7.27.4。反之，用。反之，用1mol/L HCl进行调节。注意进行调节。注意pH
17、值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。按实验要求，可将配制的培养基分装入有小倒管（德汉按实验要求，可将配制的培养基分装入有小倒管（德汉氏小管）的试管内氏小管）的试管内 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻皮纸，以防止灭菌时冷凝水润
18、湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期；用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期；将上述培养基以将上述培养基以115，20min高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。（操作演示）（操作演示）将灭菌培养基放入将灭菌培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448h，以，以检查灭菌是否彻底。检查灭菌是否彻底。分装分装按实验要求，可将配制的培养基分装入按实验要求，可将配制的培养基分装入 试管内或三角烧瓶内。试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装高
19、度以试管高度的液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，灭菌后制成斜面，如图如图-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。为宜，灭菌后垂直待凝。试管分装试管分装搁置斜面搁置斜面将灭菌的试管培养基冷将灭菌的试管培养基冷至至50左右，将试管棉左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总斜面长度以不超过试
20、管总长的一半为宜。长的一半为宜。五、实验报告五、实验报告 描述你配制的培养基灭菌前和灭菌后的颜描述你配制的培养基灭菌前和灭菌后的颜色、外观等？注意观察德汉氏小管内有无空气，色、外观等？注意观察德汉氏小管内有无空气，记录空气体积。记录空气体积。六、思考题六、思考题1 1、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题，为什么？、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题，为什么？2 2、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？无菌的？3 3、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？4 4、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到为什么要待压力降到0 0时才能打开排气阀，开盖取物？时才能打开排气阀，开盖取物？5 5、简述紫外灯灭菌的原理、应用及注意事项、简述紫外灯灭菌的原理、应用及注意事项？
