1、酶标仪的使用酶标仪的使用第一页，共50页。第二页，共50页。第三页，共50页。第四页，共50页。第五页，共50页。第六页，共50页。第七页，共50页。第八页，共50页。第九页，共50页。免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构免疫球蛋白都是大分子的物质，轻链和重链，免疫球蛋白都是大分子的物质，轻链和重链，且具有抗原结合的部位。且具有抗原结合的部位。第十页，共50页。什么是抗原什么是抗原？凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性的这种特性称为抗原性。抗原的物质可以是机抗原的物质可以
2、是机体自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有体自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外来的抗原（如病毒、污染物）。外来的抗原（如病毒、污染物）。第十一页，共50页。第十二页，共50页。第十三页，共50页。第十四页，共50页。第十五页，共50页。第十六页，共50页。第十七页，共50页。ABCD第十八页，共50页。第十九页，共50页。第二十页，共50页。二、酶标仪和多功能酶标仪二、酶标仪和多功能酶标仪1.普通酶标仪普通酶标仪2.多功能酶标仪多功能酶标仪第二十一页，共50页。1.普通酶标仪普通酶标仪即酶联免疫检测仪即酶联免疫检测仪(ELISA Reader）Bio-RadModel 5504万元
3、万元第二十二页，共50页。光源光源光电检测器光电检测器电信号经前置放大、对数放电信号经前置放大、对数放大、模数转换等大、模数转换等滤光片滤光片或单色器或单色器酶标仪结构及原理第二十三页，共50页。光源：钨灯光源：钨灯滤光片：常用的波长范围：滤光片：常用的波长范围：405nm 450nm(四甲基联苯胺四甲基联苯胺)490nm(邻苯二胺邻苯二胺)630nm单色器：可调节波长的光单色器：可调节波长的光第二十四页，共50页。第二十五页，共50页。第二十六页，共50页。第二十七页，共50页。第二十八页，共50页。Thermo公司公司全波长多功全波长多功能酶标仪能酶标仪50多万元多万元第二十九页，共50页
4、。第三十页，共50页。第三十一页，共50页。第三十二页，共50页。第二十六页，共50页。Bio-Rad Model 550酶标仪操作第三十九页，共50页。ELISA法的原理是什么？聚苯乙烯塑料微孔板：96孔一般要求有10倍左右的差异为合格。D值的误差不超过10%为合格。第三十八页，共50页。什么是抗体(Antibody)？细胞活性/细胞毒性检测 普通酶标仪测定时为什么选择双波长测定？第二十六页，共50页。凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。加显色底物（三抗），反应，洗涤。比色装置：酶标板，非比色杯（2）基于免疫反应的ELISA分析
5、。第二十六页，共50页。也有外来的抗原（如病毒、污染物）。1971年人们建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法，简称ELISA。三、酶标仪操作三、酶标仪操作 1.注意事项注意事项 2.酶标板酶标板 3.操作要点操作要点第三十三页，共50页。1.注意事项1）反复研读）反复研读试剂盒试剂盒说明，熟悉操作步骤。说明，熟悉操作步骤。2）加样的准确性。操作中须注意显色剂和）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终止的加量准确，最好使用加样枪加液终止的加量准确，最好使用加样枪加液以保证比色时吸光度的准确性。枪
6、头不以保证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。要混用。3）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗涤洗涤5次，切要把残液甩干。次，切要把残液甩干。第三十四页，共50页。按箭头光标到D/S,按select选中，enter 确定。保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。选择new session;name;next；按Start，开始测量吸光度，并自动打印测定结果。6）显色液要现用现配，避光低温保存。世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易。可提供终点检测、动力学、单孔扫描和光谱扫描等测读模
7、式；检测血清中白蛋白及免疫球蛋白；ELISA法是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。传染病诊断中检查乙型肝炎表面抗原。第二十六页，共50页。7）注意购买抗体的保存。根据标准曲线对待测抗原进行定量。D值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的O.490nm(邻苯二胺)第四十七页，共50页。二、酶标仪和多功能酶标仪在体内进行的抗原抗体反应称为免疫反应，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神通”，标准还不能统一。放板（in）,save;点击excute session;开始读板，Results,保存数据；4）观察和判读吸光度结果应在）观察和
8、判读吸光度结果应在15min 内完内完成，否则液体颜色会减退。成，否则液体颜色会减退。5）待测生物样品要放在）待测生物样品要放在4冰浴上。冰浴上。6）显色液要现用现配，避光低温保存）显色液要现用现配，避光低温保存。7）注意购买抗体的保存。）注意购买抗体的保存。第三十五页，共50页。2.2.酶标板酶标板第三十六页，共50页。酶标板材料酶标板材料 可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚纤维素、交联右旋
9、糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、丙烯、聚苯乙烯聚苯乙烯、聚乙烯及、聚乙烯及聚氯乙烯聚氯乙烯等等等。但在等。但在ELISA中最常用的是中最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯或聚氯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。由于微量反应微量反应板。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。规模应用。第三十七页，共50页。酶标板材料酶标板材料 国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，测定，并且获得了满意的结果。但并且获得了满意的结果。但每批微量反每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是应板对抗
10、原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的有显著差别的。实验证明，吸附效果似。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。极大差异，甚至完全丧失吸附能力。第三十八页，共50页。酶标板鉴定酶标板鉴定 对每批制品在使用前，必须经过实验室对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板抽样，用检测试剂盒进行试验，微量反应板抽样，
11、用检测试剂盒进行试验，当显色并终止反应后，在酶标比色计中测当显色并终止反应后，在酶标比色计中测定其定其O.D值。值。第三十九页，共50页。一般认为全板中每两孔间一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不值的误差不超过超过10%为合格。如果中间孔与四周孔为合格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应板的这一边与值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差别。一般要求有值是否有明显差别。一般要求有10倍左倍左右的差异为合格。右的差异为合格。第四十页，共50
12、页。酶标仪单、双波长检测酶标仪单、双波长检测 一般的酶标仪在测定中均有单波长和双一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，为什么呢？波长的模式，为什么呢？第四十一页，共50页。酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。等的影响较大。选择选择 630nm为参比波长为参比波长,测定其吸光度测定其吸光度A0;在测定波长（如在测定波长（如490nm/450nm）下测定）下测定样本的吸光度样本的吸光度A,双波长测定后双波长测定后,取二者的取二者的差值差值,测定结果的标准偏差比单波长下测测定结果
13、的标准偏差比单波长下测定的要小定的要小,实验误差小。实验误差小。第四十二页，共50页。在在ELISA测定所使用的底物如邻苯二胺测定所使用的底物如邻苯二胺或 四 甲 基 联 苯 胺，显 色 终 止 后，在或 四 甲 基 联 苯 胺，显 色 终 止 后，在 630nm处的吸光度值都只有吸收峰处处的吸光度值都只有吸收峰处（490nm/450nm）吸光度值的）吸光度值的1%以下，以下，因此，利用双波长检测，不会影响检测因此，利用双波长检测，不会影响检测灵敏度。灵敏度。一般酶标仪比色应该首选双波长。一般酶标仪比色应该首选双波长。第四十三页，共50页。酶标仪的工作环境酶标仪的工作环境1.仪器应放置在无强磁
14、场和干扰电压的位置。仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。2.仪器应放置在噪音低于仪器应放置在噪音低于40分贝的环境下。分贝的环境下。3.为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。4.操作环境温度应在操作环境温度应在1540之间，环境湿度在之间，环境湿度在15%85%之间。之间。5.操作时电压应保持稳定。操作时电压应保持稳定。6.操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。操作环境空气清洁，避免水汽、烟尘。7.保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。作空间。第四十四页，共50页。3.Bio-Rad Model 55
15、0酶标仪操作酶标仪操作1.接通电源，打开酶标仪开关。接通电源，打开酶标仪开关。2.仪器开始自检。仪器开始自检。Self disgonsis in progress3.按箭头光标到按箭头光标到Mode,设置参数。当仪器出现设置参数。当仪器出现set analysis mode 时，按时，按enter确定。确定。4.选择测定波长的类型。按箭头光标到选择测定波长的类型。按箭头光标到D/S,按按select选中，选中，enter 确定。光标出现在确定。光标出现在Dual/Single，选择双波长，按选择双波长，按select选中，选中，enter 确定。确定。第四十五页，共50页。5.选择滤光波长，此
16、酶标仪有四个波长：选择滤光波长，此酶标仪有四个波长：1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭头光标。按箭头光标到到Filt,按按select选中，选中，enter 确定。光标出现在确定。光标出现在Mes=#X Ref=#Y，如按光标选择数字，如按光标选择数字3，即，即490nm的测定波长的测定波长,enter确定。再按确定。再按Next,到到Ref,按按光标选择参考波长，如选数字光标选择参考波长，如选数字4.即为即为630nm，enter 确定。确定。6.选择是否混合。按箭头光标到选择是否混合。按箭头光标到Mix,按按select选中，选中，enter 确定。光标出
17、现在确定。光标出现在yes/No，如光标选择，如光标选择No，按按select选中选中,enter 确定，说明样品不混合。确定，说明样品不混合。第四十六页，共50页。7.返回原显示，返回原显示，set analysis 的的D/S FiltMix,按按enter出现出现set analysis的的Mode。说明仪器已经到。说明仪器已经到达测试状态。达测试状态。8.推开测定盖，将酶标板小心正确放到测定槽推开测定盖，将酶标板小心正确放到测定槽内，合住盖。内，合住盖。9.上好酶标仪专用的光敏打印纸。上好酶标仪专用的光敏打印纸。10.按按Start，开始测量吸光度，并自动打印测定结果。，开始测量吸光度
18、，并自动打印测定结果。11.测定完成后，取出酶标板，合上盖，关仪器开关测定完成后，取出酶标板，合上盖，关仪器开关和电源，盖上防尘罩。和电源，盖上防尘罩。第四十七页，共50页。4.Thermo多功能酶标仪的操作 1.开机，点击开机，点击 SkanIt RE for Varioskan flash2.4.3,进入分析系统；进入分析系统；2.选择选择new session;name;next；3.选择酶标板，如选择酶标板，如96孔版；孔版；next；4.选定文件夹；设定测定方法，如波长；选定文件夹；设定测定方法，如波长；5.连接仪器连接仪器connect；放板（；放板（in）,save;点击点击excute session;开始读板，开始读板，Results,保存数据；观察结果，记保存数据；观察结果，记录或保存；录或保存；6.取板（取板（out）,断开连接断开连接disconnect,关机。关机。第四十八页，共50页。思考题思考题 普通酶标仪测定时为什么选择双波长普通酶标仪测定时为什么选择双波长测定？测定？ELISA法的原理是什么？法的原理是什么？普通酶标仪和紫外分光光度计有什么普通酶标仪和紫外分光光度计有什么区别？区别？第四十九页，共50页。第五十页，共50页。
