1、基因工程原理与技术基因工程原理与技术授课教师：林良斌授课教师：林良斌 教授教授参考书：参考书：1、基因工程原理基因工程原理 吴乃虎吴乃虎 主编主编 2、植物基因工程原理与技术植物基因工程原理与技术 王关林王关林 主编主编第一章第一章 绪论绪论第一节第一节 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程基因工程(gene engineering)是现代生物技术的核心内容。是现代生物技术的核心内容。基因工程基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们
2、的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。生物技术。基因工程的基因工程的核心内容核心内容是是基因体外重组基因体外重组(DNA体外重组体外重组)。基因工程的四大要素基因工程的四大要素(或基本条件或基本条件)：目的基因目的基因、载体载体、工具酶工具酶、受体受体。相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、技术、分子克隆、基因克隆、分
3、子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因无性繁殖。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。第二节第二节 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 基因工程诞生于基因工程诞生于1973年。年。一、基因工程诞生的理论和技术基础一、基因工程诞生的理论和技术基础1、理论基础理论基础 DNA是遗传物质；是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2、技术基础技术基础 限制性核酸内切酶的发现与限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；的切割；DNA连接酶
4、的发现与连接酶的发现与DNA片段的连接；片段的连接；基因工程载体的构建与应用。基因工程载体的构建与应用。二、基因工程的诞生二、基因工程的诞生 1972年，美国斯坦福大学年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组研究小组的的DNA体外重组实验。体外重组实验。1973年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组研究小组的的DNA体外重组和大肠体外重组和大肠杆菌转化实验。杆菌转化实验。(见下两张幻灯片见下两张幻灯片)同年，加利福尼亚大学的同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。也进行了类似的实验。这一实验的成功这一实验的成功标志着基因工程标志着基因工程的诞生，因此，的诞生，因此
5、，1973年被定为基年被定为基因工程诞生的元因工程诞生的元年。年。pSC101三、基因工程的发展三、基因工程的发展 分为分为艰难阶段艰难阶段、逐渐成熟阶段逐渐成熟阶段、迅速发展阶段迅速发展阶段、鼎盛鼎盛 发展阶段发展阶段。1、基因工程的艰难阶段基因工程的艰难阶段(19731976，载体和受体系统的安全性改造载体和受体系统的安全性改造)基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2、基因工程的逐渐成熟阶段、基因工程的逐渐成熟阶段(19761982，基因工程药物的研制，基因工程药物的研制)1976年年,Genentech(Geneti
6、c Engineering Technology)公司成立公司成立(by Robert Swanson and Herb Boyer)。1977年年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽肽(见下图见下图)；1978年年Itakura（板仓）等使人生长激素（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表肽在大肠杆菌中表达成功；达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌
7、中，并通过发酵生产人胰岛素。大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业从而揭开了基因工程产业化的序幕。化的序幕。生长激素释生长激素释放抑制因子放抑制因子+从动物脑中提取从动物脑中提取5mg-50万只羊脑万只羊脑9升工程大肠杆菌升工程大肠杆菌 培养液培养液3、基因工程的迅速发展阶段、基因工程的迅速发展阶段(19822000，动植物基因工程育，动植物基因工程育种与基因治疗种与基因治疗)发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。原核生物和动物、植物细胞的载体。1982年首次通过显微注射培育出世界上第
8、一个转基因动年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物物转基因小鼠。转基因小鼠。1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物物转基因烟草。转基因烟草。1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。儿童进行基因治疗获得成功。1991年，美国提出人类基因组计划并实施。年，美国提出人类基因组计划并实施。4、鼎盛发展阶段鼎盛发展阶段(21世纪世纪)2019年完
9、成人类基因组计划。年完成人类基因组计划。至今，基因工程药物上市的有至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行几十种，上百种正在进行临床试验。临床试验。转基因植物迅速发展，目前至少有转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。种转基因植物问世。自从自从1986年年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来验以来,至今国际上已有至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进个国家批准上千例转基因植物进入田间试验入田间试验,涉及的植物种类达涉及的植物种类达50多种。多种。自从自从1994年年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少转基因延熟西红柿
10、获准上市以来，目前至少有有51种转基因植物上市。种转基因植物上市。据国际有关方面预测，到据国际有关方面预测，到 20l0 年，全世界转基因食物年，全世界转基因食物的种植面积将增至的种植面积将增至 10000 万公顷。万公顷。虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。荷兰的荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年
11、从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。亿美元。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有1-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的病人以前只能依赖于注射人的1-抗胰蛋白酶做替代疗法，抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。美元。中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。只转基
12、因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白白有活性的人凝血因子有活性的人凝血因子。第三节第三节 基因工程研究的主要内容基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容 主要包括：主要包括：基础研究基础研究（载体的研究、受体系统的研究、（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和组学研究）和应用研究应用研究等。等。1、载体的研究、载体的研究 构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。构建各种用途载体
13、及提高外源基因表达的效率。2、受体系统的研究、受体系统的研究 包括细菌、真菌、植物、动物。包括细菌、真菌、植物、动物。受体系统的安全性及转化效率。受体系统的安全性及转化效率。3、目的基因研究、目的基因研究 目的基因的分离、克隆及改造。目的基因的分离、克隆及改造。4、工具酶的研究、工具酶的研究 开发新的工具酶。开发新的工具酶。5、转化方法的研究、转化方法的研究 开发开发各种受体细胞的高效转化方法。各种受体细胞的高效转化方法。6、生物基因组学研究、生物基因组学研究 具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。因等。7、应用研究应用研究
14、包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。工业及环境保护等方面的应用。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序 分离获得带有目的基因的分离获得带有目的基因的DNA片段及载体选择与构建。片段及载体选择与构建。限制性核酸内切酶分别切割外源限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。和载体。通过通过DNA连接酶将外源基因连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，片段连接到载体上，形成重组形成重组DNA
15、分子。分子。将重组将重组 DNA分子引入到受体细胞分子引入到受体细胞(转化转化)。带有重组体细胞带有重组体细胞(转化体转化体)的扩增及选择培养。的扩增及选择培养。转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。程菌或细胞。目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达白的表达(基因功能研究或基因改造研究基因功能研究或基因改造研究)。第四节第四节 基因工程的意义与发展前景基因工程的意义与发展前景一、基因工程研究的意义一、基因工程研究的意义 大规模生产大规模生产其他生物体内含量极微但却具有
16、较高经济其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的价值的生物分子；生物分子；设计构建新物种设计构建新物种(新性状乃至全新物种新性状乃至全新物种)；搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源源(基因基因)。二、基因工程发展前景二、基因工程发展前景 基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应
17、器和环保等方面。保等方面。第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶 工具酶工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：用途分为四类：限制性内切酶限制性内切酶、连接酶连接酶、聚合酶聚合酶、修饰酶修饰酶。第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、宿主的限制一、宿主的限制-修饰现象修饰现象(见下图见下图)限制作用限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是受到限制
18、。这是 修饰作用修饰作用(modification)：指寄主本身的：指寄主本身的DNA，由于在合，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是而免遭自身限制性酶的破坏。这是R/M系统系统DNA甲基化酶甲基化酶限制性核酸内限制性核酸内切酶切酶R/M系统的作用系统的作用限制作用限制作用修饰作用修饰作用 1953年，年，Arber发现限制发现限制-修饰现象，预见限制性核修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在；酸内切酶的存在；1970年，年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个从流感嗜血杆菌中分离出
19、第一个II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶Hind II。Nathans首次用限制性酶切割首次用限制性酶切割SV40DNA。根据限制根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以有以下下4种表型：种表型：rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能。：野生型，具有完整的限制和修饰功能。rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有，但具有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。rk-mk-：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无修饰功能，也常用
20、于修饰功能，也常用于基因工程的受体基因工程的受体。rk+mk-：修饰缺陷型，缺乏修饰自身：修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能，的功能，但具有限制功能，故也称为但具有限制功能，故也称为“自杀性表型自杀性表型”(suicide phenotype)。二、限制性核酸内切酶的类型二、限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是指一类能识别双链是指一类能识别双链DNA分子中特定核分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内的核酸内切酶。切酶。简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不简称限制性内切酶或限制性酶，目前已
21、经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近同类型。至今，已发现近4000种限制酶。种限制酶。rebase.neb特性特性型型型型型型酶分子结构酶分子结构功能功能辅助因子辅助因子识别序列识别序列切割位点切割位点切割方式切割方式应用价值应用价值举例举例异源三聚体异源三聚体限制与修饰限制与修饰ATP Mg2+SAM非对称序列非对称序列距识别序列距识别序列1kb处处随机性切割随机性切割无无EcoK、EcoB同源三聚体同源三聚体限制限制Mg2+4-6bp回文序列回文序列识别序列内或附近识别序列内或附近特异切割特异切割广泛广泛EcoRI、HindIII异源二聚体异源二聚体限制与修饰限制与修饰ATP Mg2+SA
22、M非对称序列非对称序列识别序列下游识别序列下游24-26bp处处随机性切割随机性切割小小EcoPI三、限制性核酸内切酶的命名三、限制性核酸内切酶的命名1973年年H.O.Smith和和D.Nathams提出命名系统，提出命名系统，1980年年Roberts在此基础上进行了修改在此基础上进行了修改 限制性核酸内切酶第一个字母限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体大写，斜体)代表该酶的代表该酶的宿主菌属名宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体小写，斜体)代表宿主菌种名代表宿主菌种名(species)前两个字母。前两个字母。第四个字母代表宿主菌的菌株
23、名的第一个字母第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，小写，正体正体)或染色体外成分或染色体外成分(质粒或噬菌体，质粒或噬菌体，大写，正体大写，正体)。若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体正体)。Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株株 Hind Hind 四、四、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性1、II型限制性内切酶的识别序列型限制性内切酶的识别序列 一般为一般为46bp的回文序列。也
24、有的回文序列。也有6bp以上的，如以上的，如NotI，称为，称为稀稀有切割限制酶有切割限制酶。有些为。有些为反向重复序列反向重复序列(间断回文序列间断回文序列)，如，如SfiI。有些有些II型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如一，如Hind II可识别可识别4种核苷酸序列。种核苷酸序列。酶酶识别序列识别序列酶酶识别序列识别序列BamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN
25、 NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAG2、II型限制性核酸内切酶的切割方式型限制性核酸内切酶的切割方式 大多数大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链双链DNA，水解磷酸二酯键中，水解磷酸二酯键中3位的酯键，产生位的酯键，产生3端为羟基、端为羟基、5端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：在识别序列的对称轴的在识别序列的对称轴的5末端切割，产生末端切割，产生5黏性末端，黏性末端，如如
26、 EcoRI在识别序列的对称轴的在识别序列的对称轴的3端切割，则产生端切割，则产生3黏性末端，黏性末端，如如PstI在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如 PvuII 有些识别序列为间断型回文序列的有些识别序列为间断型回文序列的II限制酶，其切点位限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：于不确定核苷酸中，如：Bgl I GCCNNNNNGGC Sfi I GGCCN NNNNNGGCC Xmn I GAANNNNTTC 有极少数有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如列，如 Mbo II识别识别
27、GAAGA序列，切割位点则是：序列，切割位点则是：5 GAAGANNNNNNNN N 3 3 CT TC TNNNNNNNN N5 同裂酶同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的不同的II限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶。如：如：HpaII与与Msp I的识别序列和切割位点都相同的识别序列和切割位点都相同(CCGG)，但，但 Msp I还可以识别已甲基化的序列还可以识别已甲基化的序列CmCGG；SmaI(CCCGGG)和和 Xma I(CCCGGG)，识别序列相，识别序列相同，但切割位点不同。同，但切割位点不同。同尾酶同尾酶是指来源各异
28、、识别序列不同，但产生相同的黏是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的性末端的II限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶。如：如：BamHI (5-GGATCC-3)Bgl II(5-AGATCT-3)3、II型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能 如如 EcoRI限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与 EcoRI甲基化酶，两者均甲基化酶，两者均识别识别GAATTC序列，而前者能对序列，而前者能对GAATTC序列进行切割，序列进行切割，后者的作用是使第二个后者的作用是使第二个A甲基化。目前已经分离到许多甲基化。目前已经分离到许多II型型限制性核酸内切酶与其对应
29、的甲基化酶。限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。4、II型限制性核酸内切酶对单链型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割的切割 有一些有一些II限制性核酸内切酶，除双链限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异外，还可以特异识别并切割单链识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。如的相应位点，只是切割效率比较低。如Hha I能切割单链噬菌体能切割单链噬菌体X174和和 M13mp18 DNA，只是切割，只是切割单链单链 DNA比切割双链比切割双链 DNA效率低效率低50。五、五、限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途 产生具有相同粘性末端的产生具有相同粘性末端的DNA片段
30、，以便重组克隆；片段，以便重组克隆；建立建立DNA分子的限制酶图谱；分子的限制酶图谱；构建基因文库；构建基因文库；构建载体。构建载体。六、六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应型限制性核酸内切酶的酶切反应1、标准酶解体系的建立标准酶解体系的建立 反应体积一般为反应体积一般为20l(根据根据DNA量可适当扩大量可适当扩大)。10酶切缓冲液酶切缓冲液 2l(大部分酶反应缓冲液基本相似：大部分酶反应缓冲液基本相似：50mmol/LTris-HCl pH7.07.5、0100mmol/L NaCl、10mmol/L MgCl2、1mmol/L DTT)酶酶(根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总
31、根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积体积10 DNA样品样品(gmg)无菌水无菌水 限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的一个活力单位一个活力单位(U)为：在合适的温度和为：在合适的温度和缓冲液中，在缓冲液中，在 20 L反应体系中，反应体系中，1h完全降解完全降解 1ug 标准标准DNA所所需要的酶量。需要的酶量。2、酶解反应、酶解反应 混匀混匀 酶解酶解(温度、时间温度、时间)酶解鉴定酶解鉴定 终止终止 a、加、加EDTA至至10mmol/L；b、加、加SDS至至0.1%(W/V)；c、65水浴保温水浴保温20min(有些最适反应温度较高的有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失
32、活，如酶不能使之完全失活，如 Ace III、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA 3、限制性核酸内切酶对、限制性核酸内切酶对DNA的不完全酶解的不完全酶解(见下图见下图)不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。低反应温度等。incomplete1231+3incomplete digestion123Sma Icomplete1+2+34、限制性核酸内切酶操作的注意
33、事项限制性核酸内切酶操作的注意事项 商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；应使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的，否则酶液中的甘油浓度超过甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性；时将会抑制酶的活性；整个操作应在整个操作应在0进行，即在冰浴中进行，而且是在加进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶；入其它试剂之后，最后加入酶；尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水；尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水；当切割大量当切割大量DNA时，通常采用延
34、长反应时间，减少酶时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量；的用量；当当DNA需需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。行下一个酶切反应。七、影响限制性核酸内切酶七、影响限制性核酸内切酶活性活性与与酶切效果酶切效果的因素的因素 1、酶的纯度酶的纯度；要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。2、DNA样品的纯度样品的纯度；DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDT
35、A、SDS、高高NaCl等，都能抑制酶活性。等，都能抑制酶活性。样品中样品中DNase会降解会降解DNA，影，影响酶切。响酶切。3、酶切反应的温度酶切反应的温度、时间时间；多数多数II型限制酶最适反应温度是型限制酶最适反应温度是37，但，但SmaI为为25或或30，SfiI为为50，TaqI为为65。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。4、DNA的甲基化程度的甲基化程度；限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。这一特性有特殊用途：这一特性有特殊用途：改变某些限制性核酸内切酶的识改变某
36、些限制性核酸内切酶的识别序列；别序列；产生新的限制酶识别序列；产生新的限制酶识别序列；保护限制性核酸内切保护限制性核酸内切酶的切点；酶的切点；利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细胞胞DNA位点专一性甲基化的程度和分布。位点专一性甲基化的程度和分布。大肠杆菌中的大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶(dam)在在5GATC3序列序列中的腺嘌呤中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI 等，但等，但BamHI、Bgl II、Sau3A I不受影响。不受影响。大肠杆菌中的大肠杆菌中的DNA胞嘧啶甲基化
37、酶胞嘧啶甲基化酶(dcm)在在5CCAGG3或或5CCTGG3序列中的胞嘧啶序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但等，但Bgl I、KpnI不受影响。不受影响。采用采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒来制备质粒DNA，可防止，可防止DNA的甲基化。的甲基化。5、DNA分子的构型分子的构型 限制性内切酶对不同构型限制性内切酶对不同构型DNA分子的酶切效果是不同的，分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比线性酶解所需要的酶量，比线性DNA酶解所需要酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达的酶量高
38、许多，甚至可高达20倍。倍。有些限制性核酸内切酶对于同一有些限制性核酸内切酶对于同一 DNA分子上不同位置的分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。例如，识别序列，切割效率明显不同。例如，EcoR I、Hind III对对DNA的酶切。的酶切。6、反应缓冲液反应缓冲液 主要成分：主要成分：pH(Tris-HCl)、离子强度、离子强度(NaCl)、Mg2+；辅助成分：辅助成分：-巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)防止酶氧化；防止酶氧化；牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)组分组分V对于某些酶是必需的，可防止酶在低对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。浓度蛋白质溶液中
39、变性。星号活性星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。例如例如EcoRI在高在高pH(8)、低盐、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油和高浓度甘油(5)存在的情况下，其识别序列由存在的情况下，其识别序列由GAATTC改变为改变为NAATTN。以。以EcoRI 表示其星号活性。表示其星号活性。引起星号活性的原因有引起星号活性的原因有：高甘油含量，大于高甘油含量，大于5%；酶酶用量过大，大于用量过大，大于100U/微克微克DNA；低离子强度，小于低离子强度，小于25m
40、mol/L；高高pH，大于，大于8.0；含有机剂，如乙醇、二甲含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等；基亚砜、二甲基乙酰胺等；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非等非Mg2+的二价阳离子的存在。的二价阳离子的存在。常发生星活性的内切酶有：常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。等。第二节第二节 DNA连接酶连接酶 1967年几个实验室几乎同时发现年几个实验室几乎同时发现DNA连接酶。连接酶。一、定义与反应机理一、定义与反应机理 DNA连接酶连接酶是指能催化双链是指能催化双链DNA分子内或分子间的分子内或分子间的5-磷磷酸基和酸基和3
41、-羟基生成磷酸二酯键而使羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。链连接的一类酶。大肠杆菌和其他细菌：大肠杆菌和其他细菌：NAD+动物细胞和噬菌体：动物细胞和噬菌体：ATPT4 DNA连接酶连接连接酶连接DNA/RNA杂合分子中杂合分子中DNA链的切口链的切口DNA连接酶连接酶无连接无连接DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理二、二、DNA连接酶的种类连接酶的种类1、T4 噬菌体噬菌体DNA 连接酶连接酶(T4 DNA 连接酶连接酶)T4 DNA连接酶连接酶DNA/RNARNA 平头末端的平头末端的Km比黏性末端的比黏性末端的Km高约高约1000倍。提高平头末端连倍。提高平头末端连接效率的方
42、法：接效率的方法：加大加大酶浓度酶浓度(10100倍于粘性末端倍于粘性末端)；加大底物加大底物浓度；浓度；加入适量的一价阳离子加入适量的一价阳离子(150-200 mmol/L NaCl)；加入加入低低浓度的浓度的PEG()。ATP的最适终浓度为的最适终浓度为 0.5 mmol/L。2、大肠杆菌、大肠杆菌DNA连接酶连接酶 E.coli DNA连接酶连接酶DNA/RNAE.coli DNA连接酶连接酶无连接无连接3、T4噬菌体噬菌体RNA连接酶连接酶 用途：用途：RNA末端标记末端标记pNpNNNNT4 RNA连接酶连接酶三、三、DNA连接酶的反应体系连接酶的反应体系 DNA连接酶的活性单位较
43、通用的是连接酶的活性单位较通用的是韦氏韦氏(Weiss)单位单位，一，一个韦氏单位是指在个韦氏单位是指在37，20 min内催化从内催化从,-32P-ATP的焦磷的焦磷酸根置换出酸根置换出1nmol32P所需要的酶量。所需要的酶量。M-L单位：以单位：以d(A-T)n作为底物作为底物 黏性末端连接单位：以黏性末端连接单位：以 DNA/Hind III片段为底物片段为底物 一个韦氏单位相当于一个韦氏单位相当于0.2个个M-L单位或者单位或者60个黏性末端连接个黏性末端连接单位。单位。反应体系反应体系：10L或或20L，DNA片段片段，连接酶连接酶，Buffer，温温度度(1216或或30)，时间
44、时间(416h)Buffer：50mmol/LTris-HCl pH7.6，10mmol/L MgCl2，0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素1、DNA末端的浓度末端的浓度 连接产物的分子构型连接产物的分子构型(线形线形或或环状环状)与与DNA浓度及浓度及DNA分子长分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子度存在密切关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的度
45、增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段载体片段=2:1。2、反应温度反应温度 介于最适温度与其介于最适温度与其Tm之间。之间。30会导致会导致T4 DNA连接酶的连接酶的不稳定。不稳定。3、ATP浓度浓度 ATP最适的终浓度为最适的终浓度为0.5mmol/L，浓度过高会抑制连接。，浓度过高会抑制连接。第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶分为：聚合酶分为：依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶；聚合酶
46、；依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。常用的常用的DNA聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I、Klenow片段酶、片段酶、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶、聚合酶、T7噬噬DNA聚合酶、聚合酶、Taq DNA聚合酶、逆转聚合酶、逆转录酶。录酶。酶酶聚合反应聚合反应速度速度53外切酶外切酶活性活性35外切酶外切酶活性活性持续合成能力持续合成能力E.Coli DNA聚合酶聚合酶I中速中速有有低低低低Klenow酶酶中速中速无无低低低低T4DNA聚合酶聚合酶中速中速无无高高低低T7 DNA聚合酶聚合酶快速快速无无高高高高修饰修饰T7 DNA聚合酶聚合酶快速快速无无低或无低或无高高
47、Taq DNA聚合酶聚合酶快速快速有有无无高高逆转录酶逆转录酶低速低速无无无无中中一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 53聚合酶活性聚合酶活性53外切酶活性外切酶活性：双链：双链DNA带磷酸基团的带磷酸基团的5端或端或 DNA/RNA杂合分子中的杂合分子中的RNA5端端35外切酶活性外切酶活性切口平移作用切口平移作用DNA Pol I主要用途：主要用途：切口平移法切口平移法制备制备DNA探针探针 反应体系：在反应体系：在25l反应体系中含有反应体系中含有1 g纯化的特定纯化的特定DNA片断，并加入适量的片断，并加入适量的DNase、Pol、-32p-dNTPs和未标和未标记的记的dN
48、TPs。DNaseI，Mg2+Pol I，-32p-dCTP，dNTPs二、二、Klenow 片段片段 标记标记3凹陷末端的凹陷末端的DNA分子或平末端；分子或平末端；DNA末端标记一般标记活性不高，极少用于分子杂交探末端标记一般标记活性不高，极少用于分子杂交探针的标记，主要用于针的标记，主要用于DNA序列测定等所需片段的标记。序列测定等所需片段的标记。合成合成cDNA第二链；第二链；双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法测定测定DNA序列；序列；在单链模板上延伸在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体成杂交探针和进行体外突变。外突变。聚合酶Klenow DNA -32
49、PdNTP双链DNA粘端5-外切酶变性+5335353533555533标记探针标记末端平末端标记平末端标记三、三、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35 外切酶活性，缺少外切酶活性，缺少53外外切酶活性。其切酶活性。其35外切酶活性比外切酶活性比Klenow酶高酶高1001000倍。倍。在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH端外切端外切(即可降解即可降解dsDNA，只是其活性比只是其活性比ssDNA低很多低很多)，在只有一种，在只有一种dNTP时，外切至互补时，外切至互补核苷酸，在四种核苷酸，在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。均存
50、在时，聚合活性占主导地位。T4 DNA聚合酶的聚合酶的置换合成作用置换合成作用无无dNTP时，时，T4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTP时，时，T4 DNA聚合酶聚合酶T4 DNA聚合酶的用途：聚合酶的用途：切平核酸内切酶产生的切平核酸内切酶产生的3黏性末端黏性末端 末端标记。特别是不需要核酸外切酶帮助就可进行平末端标记。特别是不需要核酸外切酶帮助就可进行平末端标记，这种探针标记方法称为末端标记，这种探针标记方法称为置换置换(取代取代)合成法合成法。置换合成法将产生一组末端完全标记、而从末端到中点置换合成法将产生一组末端完全标记、而从末端到中点其标记量递减的分子。其标记量递减的分子。四、四、T7
