1、第十二章第十二章 分子发光分析分子发光分析Chapter Twelve:Molecular Luminescence Analysis第1页，共70页。第一节第一节 分子荧光和磷光分子荧光和磷光molecular fluorescence and phosphorescence第二节第二节 分子荧光和磷光分析法分子荧光和磷光分析法molecular fluorescence and phosphorescence analysis第三节第三节 分子发光分析分子发光分析chemiluminescence analysis第2页，共70页。光光谱谱分分析析原原子子光光谱谱（略略）分分子子光光谱谱分
2、分子子吸吸收收U UV V-V Vi is s（紫紫外外-可可见见）I IR R（红红外外）分分子子发发光光光光致致发发光光其其它它发发光光形形式式如如：化化学学发发光光等等荧荧光光、磷磷光光(对光的吸收对光的吸收)第一节第一节 分子荧光和磷光分子荧光和磷光第3页，共70页。历史：历史：第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，他于，他于1575年提到，在含有一种称为年提到，在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。以的木头切片的水溶液中，呈现出极为
3、可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。识都没有明显的进展。直到直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了念，并提出了“荧光荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓
4、这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。现象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年年，Goppelsrde应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。上首次进行的荧光分析工作。第4页，共70页。一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluoresce
5、nce phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；量子化；跃迁一次到位；激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(能级图能级图)；速度最快、激发态寿命最；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；短的途径占优势
6、；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发单重态单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发三重态三重态 T1、T2 ；第5页，共70页。每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用，用M=2S+1表示，表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为为各电子自旋量子数的代数和，其数值为
7、0或或1。根据根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的所有电子都是自旋配对的，则，则S=0,M=1,该分子便处于单重态该分子便处于单重态(或叫单重线或叫单重线)，用符号，用符号S表示。表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激
8、发的单重态；，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子具有两个自旋不配对的电子，即即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，分子处于激发的三重态，用符号用符号T表示。表示。2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度第6页，共70页。电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)；处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪洪特规则特规则)，三重态
9、能级比相应单重态能级低；三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入；进入的几率小；的几率小；第7页，共70页。3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光发光)和和无辐射跃迁等方式失去能量；无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐
10、射跃迁无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；大；荧光：荧光：10-710-9 s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：10-4100s；第一激发；第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；第8页，共70页。其中其中S0、S1和和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1
11、、2、3、表示基态和激发态的振动能级。表示基态和激发态的振动能级。第9页，共70页。非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程:振动弛豫振动弛豫(Vibration relaxation，简写为，简写为VR)：当分子吸收光辐射后可能从基当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能级态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态跃迁到激发单重态Sn(如图中如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高
12、振动能级跃迁至该电子能级的最低以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为发生振动弛豫的时间为1012s数量级。数量级。内转换内转换(Internal conversion，简写为，简写为IC)：当高电子能级中的低振动能级当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。迁形式转移至低电子能级。电子可以通过振动能级的重叠从电子可以通过振动能
13、级的重叠从S2跃迁至跃迁至S1，或从，或从T2跃迁跃迁至至T1。这个过程称为内部转移。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为内部转移的时间为1011s1013s数量级。振动弛豫及内部转数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一第一)激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。第10页，共70页。外转换外转换(External conv
14、ertion,EC)：激发态分子与溶剂分子或其激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的非辐射跃迁称为外部它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的非辐射跃迁称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为象称为“猝灭猝灭”或或“熄灭熄灭”。系间跨越系间跨越(Intersystem Crossing,ISC)：指不同多重态之间的指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一如由第一激发单重态激发单重态S1跃迁至第一激发三重态跃迁至
15、第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律不符合光谱选律)，但如果两，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如中个能态的能层有较大重叠时，如中S1的最低振动能级与的最低振动能级与T1的较高振的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。第11页，共70页。第12页，共70页。辐射能量传递过程辐射能量传递过程:荧光荧光发射发射(Fluorescence em
16、ission,FE)：电子由第一激发单重态的最低振电子由第一激发单重态的最低振动能级动能级基态（基态（多为多为 S1 S0跃迁），发射波长为跃迁），发射波长为 2的荧光；发射荧光的能的荧光；发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长量比分子吸收的能量小，波长长（为什么？为什么？）；）；第一激发单重态最低振动能第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为级的平均寿命约为109104s，因此荧光寿命也在这一数量级。，因此荧光寿命也在这一数量级。2 2 1；磷光磷光发射发射(Phosphorescence emission,PE)：激发态的电子经系间跨跃激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振
17、动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为为104100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及跨跃及T1 中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即中振动弛豫丢失了一部分能量，所以
18、磷光波长比荧光波长要长，即 3 2。第13页，共70页。延迟荧光延迟荧光 T1还可能通过热激发而重新跃回还可能通过热激发而重新跃回S1 即即T1 S1，然后再，然后再由由S1经辐射跃迁回经辐射跃迁回S0，即，即S1S0，发出荧光，这种荧光称为延，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。长比磷光短。第14页，共70页。一、激发（吸收）光谱与荧光一、激发（吸收）光谱与荧光(磷光磷光)光谱（发射）光谱（发射）excitation spectrum and fluore-scence spectrum1.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激
19、发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发射的荧光化合物发射的荧光(磷光磷光)强度与照射光波长的关系曲线强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸吸收收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数
20、及依据。照射光波长如何选择们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。照射光波长如何选择？第二节第二节 分子荧光和磷光分析法分子荧光和磷光分析法第15页，共70页。2.2.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长固定激发光波长(选最大激发波长选最大激发波长),),化合物发射的荧光化合物发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发与发射光波长关系曲线射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线IIII或或III)III)。通过激发光谱，选择最佳激发波长通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光发射荧光(磷光磷光)强度最大的激发光波长强度最大的激发光波长，常用，常用ex表示。通过发射光谱选择最佳表示。
21、通过发射光谱选择最佳的发射波长的发射波长发射荧光发射荧光(磷光磷光)强度最强度最大的发射波长，常用大的发射波长，常用em表示。磷光发表示。磷光发射波长比荧光来得长射波长比荧光来得长 第16页，共70页。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱第17页，共70页。3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫
22、消耗了能量。激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关；发射光谱的形状与激发波长无关；荧光激发光谱的形状与发射波长荧光激发光谱的形状与发射波长无关无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图如能级图 2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如 2)c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
23、样）成镜像对称关系。）成镜像对称关系。第18页，共70页。镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似激发态上的各振动能级分布类似 假如吸收时由假如吸收时由S0的的V=0与第一激发态与第一激发态S1的的V=2 之间的跃迁几率最大之间的跃迁几率最大(即强度最大即强度最大)，那么在荧光，那么在荧光发射时，由发射时，由S1的的V=0跃回跃回S0的的V=2的几率也应该最大的几率也应该最大，如图所示。基于上述原因，如图所示。基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系之间显现镜像对称关系第19页，共
24、70页。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱第20页，共70页。二、荧光的产生与分子结构的关系二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular relation between fluorescence and molecular structurestructure 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1 1）具有合适的结构；）具有合适的结构；a.具有具有-电子跃迁类型的结构电子跃迁类型的结构 b
25、.具有大的共轭具有大的共轭键结构键结构（2 2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：发射的光量子数吸收的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；过程速度快，不出现荧光发射；第21页，共70页。2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1 1）跃迁类型：跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；利于荧光的产生；（2 2）共轭效应：共轭效应：提高共轭度有利于增加荧
26、光效率并产生红移提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3 3）刚性平面结构：刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。有。又如芴与联二苯，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两又如芴与联二苯，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为，后者仅为0.18。萘。萘与与维生素维生素A都具有都具有5个
27、共轭个共轭键，键，而前者为平面结构，后者为非而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的度为后者的5倍。倍。（4 4）取代基效应：取代基效应：芳环上有供电芳环上有供电基，使荧光增强。基，使荧光增强。影响规律多出自影响规律多出自实验总结和推测实验总结和推测第22页，共70页。O-OCOO-O-OCOO-NH2萘 紫外区蒽 蓝区丁省 绿区1）共轭结构2）刚性的平面结构荧光黄会发荧光酚酞不发荧光3）取代基第23页，共70页。第24页，共70页。取代基的影响主要有以下几个方面：取代基的影响主要有以下几个方面：1、给电子取代基使荧光加强、给电子取代基使荧光加强
28、2、吸电子基团使荧光减弱而磷光增强、吸电子基团使荧光减弱而磷光增强 3、取代基位置的影响、取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者抑制荧光取代者抑制荧光(CN取代基例外取代基例外)。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。如化合物萘环上的如化合物萘环上的8位引入位引入SO3基时，由于空间阻碍使基时，由于空间阻碍使NR2与萘之间的键扭转而减弱与萘之间的键扭转而减弱了平面构型，影响了了平面构型，影响了p共轭，共轭，导致荧光的减弱。导致荧光的减弱。同样，
29、同样，1,2二苯乙烯的反式异二苯乙烯的反式异构体是强荧光物质，而顺式异构体是强荧光物质，而顺式异构体不发射荧光。构体不发射荧光。4、重原子效应、重原子效应 荧光体取代上重原子后，荧光荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和和I)原子取代原子取代 第25页，共70页。三、影响荧光强度的因素三、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的
30、影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.3.溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pHpH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；第26页，共70页。4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自吸现象：自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长
31、端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；光，如色胺酸中的重铬酸钾；第27页，共70页。5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 荧光的猝灭荧光的猝灭(熄灭熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光物质分子物质的浓度呈线性关系的作用。从狭
32、义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型型:碰撞猝灭碰撞猝灭生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭能量转移猝灭能量转移猝灭 氧的猝灭氧的猝灭 转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭 荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 第28页，共70页。四、四、荧光分析仪荧光分析仪 荧光分析仪
33、器与紫外荧光分析仪器与紫外-可见分光光度可见分光光度计的基本组成部件相同，即有：计的基本组成部件相同，即有：光源、单色器、样品池、检测器和记录光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置显示装置五个部分。五个部分。第29页，共70页。1 1、仪器结构流程、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录显示系统。色器系统、检测器、记录显示系统。特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单色器：单色器：选择激发光波长的第选
34、择激发光波长的第一单色器和选择发射光一单色器和选择发射光(测量测量)波长的第二单色器；波长的第二单色器；光源：光源：氙灯氙灯、钨卤素灯和高压汞灯、钨卤素灯和高压汞灯，染料激光器，染料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。第30页，共70页。第31页，共70页。仪仪器器光光路路图图第32页，共70页。仪器框图该型仪器可进行该型仪器可进行荧光、磷光和发荧光、磷光和发光分析；光分析；第33页，共70页。同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为系，同步扫描可分为固定波
35、长差固定波长差()和固定能量差及可变波长和固定能量差及可变波长三三种；种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；光谱重叠，提高分辨率；如图。如图。合适的合适的可可减少光谱重叠；减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但光谱严重重叠，但60nm时，只显示时，只显示色氨酸色氨酸的特征光谱，实现分别测定的特征光谱，实现分别测定第34页，共70页。可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光
36、谱图光光谱图第35页，共70页。磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量（荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量（采用低温采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻）。在有荧光发射的同时测）。在有荧光发射的同时测量磷光。量磷光。测量方法：测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶室温测量时，不需要杜瓦瓶(盛有液氮盛有液氮)。第36页，共
37、70页。五、荧光分析方法与应用五、荧光分析方法与应用1.特点特点（1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级个数量级 检测下限：检测下限：0.10.001 gmL1 其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测
38、器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低。，所以检测限较低。（2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少）试样量少 缺点：应用范围小。缺点：应用范围小。第37页，共70页。用用检测限来表示荧光法的灵敏度检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法：方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法：一是以喹宁表示，在一是以喹宁表示，在0.05molL1硫酸中，喹宁的荧光峰为硫酸中，喹宁的荧光峰为450nm，当，当喹宁溶液很稀（如喹宁溶液很
39、稀（如0.05gL1）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为0.05gL1喹宁，有些灵敏度高的仪器可达喹宁，有些灵敏度高的仪器可达0.005gL1喹宁；喹宁；二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的畸变，在极短的时间内（畸变，在极短的时间内（10121
40、015s），会向各个方向发射出与激发），会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。度已为较多的产家所采用。第38页，共70页。常规分析应用：常规分析应用：定性分析：定性分析：f；ex；em；峰形等；峰形等 定量
41、检测：定量检测：F=KI0fC 其它（略）其它（略）高端生化研究：高端生化研究：分子相互作用研究；分子相互作用研究；代谢动力学跟踪；代谢动力学跟踪；显微成像显微成像（物理迁移与化学衍化的原位（物理迁移与化学衍化的原位“显迹显迹”）第39页，共70页。2.定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0
42、l c =Kc第40页，共70页。（2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；第41页，共70页。3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。多种元素。铍、铝
43、、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析第42页，共70页。第43页，共70页。第44页，共70页。4、磷光分析法的应用、磷光分析法的应用（1）稠环芳烃分析）稠环芳烃分析 采取固体表面
44、室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表（致癌物质）；见表（2）农药、生物碱、植物生长激素的分析）农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析等分析 检测限检测限0.01 g/cm-3（3）药物分析和临床分析）药物分析和临床分析 见表见表第45页，共70页。第46页，共70页。第47页，共70页。化学发光分析仪化学发光分析仪 美国美国MD公司公司 型号型号 Lmax II/II384 检测器：光子计数器检测器：光子计数器 第48页，共70页。按化学反应类型按化学反
45、应类型 酶促化学发光：酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统辣根过氧化物酶系统 碱性磷酸酶系统碱性磷酸酶系统 黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：非酶促化学发光：吖啶酯系统吖啶酯系统 草酸酯系统草酸酯系统 三价铁三价铁-鲁米诺系统鲁米诺系统闪光（闪光（Flash）:按发光持续时间按发光持续时间发光时间在数十分钟以上，如：发光时间在数十分钟以上，如：HRP-Luminol系统系统 AP-AMPPD系统系统 黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、无须原位进样、以速率法测量。以速率法测量。发光时间在数秒内，如吖啶酯发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样以原位进样(In Situ Inje
46、ctor)和时间积分法测和时间积分法测量量辉光（辉光（Glow）:化学发光的分类化学发光的分类第49页，共70页。免疫测定免疫测定 是利用抗原抗体反应来测定标本中微量物质的方法。化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型 第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。第50页，共70页。化学发光免疫分析化学发光免疫分析目前分类目前分类 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.1.发光酶免疫测定技术（发光酶免疫测定技术（CLEIACLEIA）2.2.化学发光免
47、疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLIA)(ECLIA)escence escence immunoassayimmunoassay第51页，共70页。第52页，共70页。临床应用广临床应用广1 1）甲状腺激素）甲状腺激素 2 2）生殖激素）生殖激素3 3）肾上腺）肾上腺/垂体激素垂体激素 4 4）贫血因子）贫血因子5 5）肿瘤标记物）肿瘤标记物 6 6）感染性疾病）感染性疾病7 7）糖尿病）糖尿病 8 8）心血管系统）心血管系统9 9）病毒标记物）病毒标记物 1010）骨代谢）骨代谢1111）过敏性疾病）过敏性疾病
48、 1212）治疗药物监测）治疗药物监测第53页，共70页。1 1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是、在分子荧光法中，以下说法中正确的是 （）（1 1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态 （2 2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态 （3 3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些 （4 4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2 2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是、在分子荧光分析
49、法中，下面说法正确的是（）（1 1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变 （2 2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变 （3 3）荧光激发光谱与它的紫外可见吸收光谱互为镜像对称关系）荧光激发光谱与它的紫外可见吸收光谱互为镜像对称关系 （4 4）荧光发射光谱与它的紫外可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样）荧光发射光谱与它的紫外可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是 _和和_。4、下列哪一种分子的去激
50、发过程是荧光过程、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第54页，共70页。1 1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是、在分子荧光法中，以下说法中正确的是 （）（1 1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已
