1、1Rho激酶及其抑制剂临床研究进展激酶及其抑制剂临床研究进展心脑血管疾病治疗新策略Ras蛋白蛋白 癌基因癌基因 1976年从劳斯肉瘤病毒中分离得到了第一个能年从劳斯肉瘤病毒中分离得到了第一个能使细胞癌变的基因（取肉瘤使细胞癌变的基因（取肉瘤sarcoma的缩写，的缩写，sac基因），人们称这种基因为癌基因基因），人们称这种基因为癌基因（oncogenes）Ras 人类的第一个癌基因是人类的第一个癌基因是1982年美国科学家从人年美国科学家从人膀胱癌细胞中找到的，因为它和先前已经获得的膀胱癌细胞中找到的，因为它和先前已经获得的鼠肉瘤病毒的癌基因完全相同，故命名为鼠肉瘤病毒的癌基因完全相同，故命名
2、为ras基基因（取鼠肉瘤因（取鼠肉瘤rat sarcoma的缩写，的缩写，ras基因）。基因）。Rho蛋白蛋白 属于属于Ras超家族，超家族，Ras homologous的缩写的缩写 小的小的GTP酶，两种存在形态酶，两种存在形态Rho-GDP Rho-GTP Rho基因的发现基因的发现 1985年，年，Madaule 及及Axel报道了一个新的报道了一个新的ras基因成员基因成员rho基因，与经典的基因，与经典的ras基因（基因（N-,K-及及H-ras）具有某些相同的特性。）具有某些相同的特性。Rho基因首先从基因首先从Aplysia（雨虎）的腹腔神经（雨虎）的腹腔神经节节cDNA文库分离
3、出来，编码的蛋白质中文库分离出来，编码的蛋白质中35的氨基酸与的氨基酸与H-ras同源。同源。rho进化中高度保进化中高度保守的区域在果蝇、大鼠、人等均可发现。序守的区域在果蝇、大鼠、人等均可发现。序列分析显示，人与果蝇的列分析显示，人与果蝇的rho基因基因85同源。同源。Rho家族成员及其底物家族成员及其底物 Rho家族成员家族成员 RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、TC10、TCL、Chp、Wrch-1、Rac1、Rac2、Rac3、RhoG、Rac1b、Rnd1、Rnd2、Rnd3/RhoE、RhoD、Rif、RhoH/TTF RhoB、TB1、RhoBTB2、Miro-1 底物
4、（效应因子）底物（效应因子）ROCKI、ROCK II、mDia、PRK1/2 PKN、Rhoteckin、Rhophillin、Kinectin、Citron Kinase、MBS、p76RBE、PKC epsilon、DBl transcription factorROK（Rho-kinase）及其分布）及其分布 ROK （或（或ROCK II,Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase II）及及ROK （ROCK I）结构十分相似，分子量均为）结构十分相似，分子量均为160kDa。在哺乳动物的大多数组织内均有表达，一般以无活
5、在哺乳动物的大多数组织内均有表达，一般以无活性形态存在于胞浆内，在激活后转移到胞膜处起作性形态存在于胞浆内，在激活后转移到胞膜处起作用。用。ROCKI及及ROCKII氨基酸序列氨基酸序列65相同，激酶相同，激酶区相似性区相似性92。含高度保守的富含半胱氨酸含高度保守的富含半胱氨酸/组氨酸区域，与组氨酸区域，与RhoA,RhoB及及 RhoC结合，结合，Rho结合区包含结合区包含30AAs。ROCK II主要在脑内表达，而主要在脑内表达，而ROCK I主要在非神经主要在非神经元组织表达，包括心脏、肺、骨骼肌等。元组织表达，包括心脏、肺、骨骼肌等。RhoROK信号通路功能信号通路功能 主要调节细胞
6、骨架蛋白合成和降解、移动、收缩等主要调节细胞骨架蛋白合成和降解、移动、收缩等 参予细胞的基本生命过程参予细胞的基本生命过程 细胞迁移细胞迁移 细胞增殖细胞增殖 细胞存活细胞存活Rho图片Rho激酶活化的病理过程激酶活化的病理过程 Rho激酶研究进展激酶研究进展VSMC hypercontraction 血管平滑肌细胞过收缩血管平滑肌细胞过收缩Cerebral vasospasm 神经外科脑血管痉挛神经外科脑血管痉挛Coronary vasospasm 冠状动脉血管痉挛冠状动脉血管痉挛Hypertension 高血压高血压Pulmonary hypertension 肺动脉高压肺动脉高压Sudd
7、en death 猝死猝死 Arteriosclerotic diseases 动脉粥样硬化病变动脉粥样硬化病变Angina 绞痛绞痛Myocardial infarction 高胆固醇心肌梗死高胆固醇心肌梗死Restenosis 再狭窄再狭窄Stroke 卒中卒中Hypertensive vascular disease 原发性高血原发性高血压压Heart failure 心功能衰竭心功能衰竭Cardiac allograft vasulopathy 心脏移植物血心脏移植物血管病变管病变Vein graft disease 静脉内膜增生静脉内膜增生 Other SMC disorders 其
8、他平滑肌细胞痉挛其他平滑肌细胞痉挛Bronchial asthma 支气管哮喘支气管哮喘Glaucoma 青光眼青光眼Others 其他其他Osteoporosis 骨质增生骨质增生Erectile dysfunction 勃起障碍勃起障碍Cancers 癌症癌症Hiroaki Shimokawa,Akira Takeshita,Rho-Kinase Is an Important Therapeutic Target in Cardiovascular Medicine,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2005;25:1767-1775.)Confirmed in
9、 humans 人体实验确认人体实验确认 Confirmed in animal models 动物模型确认动物模型确认Rho激酶抑制剂激酶抑制剂 国际上已经用于临床应用的国际上已经用于临床应用的Rho激酶抑制剂，有盐酸激酶抑制剂，有盐酸法舒地尔法舒地尔（fasudil hydrochloifde，FH，又名，又名 HA1077,AT877）国内产品已经国内产品已经2004年上市，商品名：年上市，商品名：另有两种化合物处于研究中：另有两种化合物处于研究中：Y-27632和和H-1152P盐酸法舒地尔盐酸法舒地尔fasudil hydrochloifde不同的不同的Rho激酶抑制剂的对各种激酶的
10、抑制激酶抑制剂的对各种激酶的抑制情况情况IC50(M)fasudil(HA1077)H-1152P Y-27632ROK 0.158 0.0120 0.162AuroraA 100 0.745 100GSK3 100 60.7 50.0AMPK 100 100 100KK 100 100 100CK2 100 100 100Erk1 100 100 100P38 100 100 100JNK11 100 100 100MKK4 100 16.9 100Abl 100 7.77 100Src 100 3.06 100EGFR 100 50.0 100神经血管单元和多靶点治疗神经血管单元和多靶点治
11、疗 2002年美国神经疾病和脑卒中研究院在对年美国神经疾病和脑卒中研究院在对“脑脑卒中进展回顾的报告卒中进展回顾的报告”中明确提出了中明确提出了“神经血神经血管单元（管单元（neurovascular unit，NVU）”概念，概念，并于并于2004年又进一步补充年又进一步补充 脑卒中后可导致脑卒中后可导致NVU功能异常，功能异常，NVU功能异常功能异常可进一步导致脑卒中后脑损害的进展；要求在可进一步导致脑卒中后脑损害的进展；要求在细胞、分子和基因水平研究细胞、分子和基因水平研究NVU功能及机制。功能及机制。Rho激酶在神经血管单元中的作用激酶在神经血管单元中的作用Rho激酶激酶作用于肌动蛋作
12、用于肌动蛋白骨架系统引起轴突生白骨架系统引起轴突生长锥长锥回缩及塌陷回缩及塌陷,从而从而抑制轴突生长。抑制轴突生长。决定轴突、树突生长及决定轴突、树突生长及相互构成联系的重要信相互构成联系的重要信号蛋白号蛋白,对神经发育和重对神经发育和重塑起重要作用。塑起重要作用。Rho 激酶信号通路异常激酶信号通路异常可影响神经网络形成。可影响神经网络形成。Rho 激酶与脑激酶与脑卒中（卒中（Stroke）啮齿类动物研究显示：啮齿类动物研究显示：ROK抑制剂对急性期多发性抑制剂对急性期多发性脑梗死动物模型及脑梗死动物模型及NMDA兴奋毒性模型具有神经保兴奋毒性模型具有神经保护作用。护作用。神经复性抑制因子（
13、神经复性抑制因子（NgR1、NOGO-A）及神经生）及神经生长抑制因子等存在于梗死及发生坏死的半暗带区域，长抑制因子等存在于梗死及发生坏死的半暗带区域，过度激活过度激活ROK，抑制神经复性及再生，说明，抑制神经复性及再生，说明ROK抑抑制剂对脑卒中恢复期有效。制剂对脑卒中恢复期有效。抑制炎性反应，抑制脑卒中迟发性神经元丧失。抑制炎性反应，抑制脑卒中迟发性神经元丧失。减少脑梗死体积和促进神经功能恢复减少脑梗死体积和促进神经功能恢复RhoRho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用RhoRho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用 增
14、加局部脑血流量，上调内皮细胞增加局部脑血流量，上调内皮细胞NOS活性，减少活性，减少梗死体积。梗死体积。Regional cerebral blood flow.Cerebral blood flow 2hours after MCA occlusion in mice treated with vehicle or 10mg/kg fasudil for 2 days were measured by 14C-iodoantipyrine autoradiography.Two independent experiments yielded similarresults.Rho 激酶抑制剂对
15、急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用Rho激酶抑制剂可促进轴突生长。激酶抑制剂可促进轴突生长。Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用 国外的一项设计严格，前瞻性、双盲、对照临床研究国外的一项设计严格，前瞻性、双盲、对照临床研究证实，证实，48h内应用盐酸法舒地尔可显著改善急性脑栓内应用盐酸法舒地尔可显著改善急性脑栓塞患者的神经功能及临床结局。塞患者的神经功能及临床结局。Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用Rho 激酶抑制剂
16、对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用 结论：在急性脑卒中发病后结论：在急性脑卒中发病后48h内应用法舒地尔内应用法舒地尔fasudil进行治疗可显著改善患者的临床结局。本研进行治疗可显著改善患者的临床结局。本研究发现法舒地尔究发现法舒地尔fasudil是治疗缺血性脑卒中有效且是治疗缺血性脑卒中有效且安全的药物安全的药物Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用 脑血管痉挛（脑血管痉挛（CVS）是动脉
17、瘤性蛛网膜下腔出血）是动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）患者导致致残和死亡的一个主要原因。）患者导致致残和死亡的一个主要原因。Rho激酶通过直接磷酸化激酶通过直接磷酸化MLC及抑制及抑制MLCP活性促进活性促进MLC的磷酸化的磷酸化,增强血管平滑肌的收缩增强血管平滑肌的收缩,它与依赖它与依赖Ca2+的激活通路协同作用的激活通路协同作用,在在CVS的发病机制中发挥重要的发病机制中发挥重要作用。作用。盐酸法舒地尔通过抑制盐酸法舒地尔通过抑制Rho激酶，主要扩张中、小动激酶，主要扩张中、小动脉（如脉（如Willis环等），改善脑血管痉挛引起的脑缺血环等），改善脑血管痉挛引起的脑缺血症状症状,更有效更安
18、全的治疗更有效更安全的治疗CVS。Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用 国内进行的随机、双盲、双模拟、阳性对照临床研究国内进行的随机、双盲、双模拟、阳性对照临床研究证实，应用盐酸法舒地尔与经典预防脑血管痉挛药品证实，应用盐酸法舒地尔与经典预防脑血管痉挛药品尼莫地平比较疗效不具有显著性差异，但使用安全性，尼莫地平比较疗效不具有显著性差异，但使用安全性，方便性方面优于尼莫地平。方便性方面优于尼莫地平。Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用两组疗效评价情况及比较（两组疗效评价情况及比较（PP分析）分析）Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用激酶
19、抑制剂在脑血管痉挛中的应用两组疗效评价情况及比较（两组疗效评价情况及比较（ITT分析）分析）Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用 随机开放式研究：随机开放式研究：72例，盐酸法舒地尔例，盐酸法舒地尔fasudil与尼莫与尼莫地平对照。对地平对照。对SAH血管痉挛及神经系统损害结局的观血管痉挛及神经系统损害结局的观察，显示察，显示fasudil预防血管痉挛优于尼莫地平，其副作预防血管痉挛优于尼莫地平，其副作用少于尼莫地平，且具有神经保护作用。用少于尼莫地平，且具有神经保护作用。Effect of fasudil hydrochloride,a protein kin
20、ase inhibitor,on cerebral vasospasm and delayed cerebral ischemic symptoms after aneurysmal subarachnoid hemorrhage.Neurol Med Chir(Tokyo).2006 Sep;46(9):421-8.从从1995年年6月月2001年年6月，近月，近52,000例动脉瘤性蛛例动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者接受了法舒地尔的治疗，以防治其网膜下腔出血患者接受了法舒地尔的治疗，以防治其脑血管痉挛。已证实患者对法舒地尔具有良好的耐受脑血管痉挛。已证实患者对法舒地尔具有良好的耐受性。性。Sh
21、ibuya M,Hirai S,Seto M,Satoh S,et al Effects of fasudil in acute ischemic stroke:results of a prospective placebo-controlled double-blind trial.J Neurol Sci.2005 Nov 15;238(1-2):31-9.Rho激酶在心血管系统疾病中的作用激酶在心血管系统疾病中的作用内皮细胞功能不全VSMC增殖迁移VSMC表型改变VSMC收缩性 炎性细胞粘附基质金属蛋白酶 血管重构血管重构血管增生血管增生血栓形成血栓形成血管收缩性血管收缩性 血管功能血
22、管功能 内膜中膜急性冠脉综合征急性冠脉综合征Rho-kinaseRho-kinase滋养血管密度 炎性细胞浸润肌成纤维细胞 外膜Rho激酶抑制剂激酶抑制剂对稳定性心绞痛患者血管的舒张作用对稳定性心绞痛患者血管的舒张作用11例稳定性心绞痛患者和例稳定性心绞痛患者和9例正常者行冠脉造影，先后静脉给予硝酸甘油和法舒地例正常者行冠脉造影，先后静脉给予硝酸甘油和法舒地尔，观测对冠状动脉内径的影响。显示法舒地尔可以特异性扩张狭窄部分的血管。尔，观测对冠状动脉内径的影响。显示法舒地尔可以特异性扩张狭窄部分的血管。血管管径变化01020305%22%P0.05硝酸甘油硝酸甘油200g IVg IV法舒地尔法舒
23、地尔30mg VD对冠状动脉无狭窄部位的血管舒张作用对冠状动脉无狭窄部位的血管舒张作用Otsuka T,et al.Circ J.2006;70(4):402-8.Rho激酶抑制剂激酶抑制剂对稳定性心绞痛患者的运动耐量作用对稳定性心绞痛患者的运动耐量作用84例稳定性心绞痛患者分为两组，一组服用安慰剂，一组服法舒地尔例稳定性心绞痛患者分为两组，一组服用安慰剂，一组服法舒地尔(80mg/d)，8周后行运动试验，实验证明法舒地尔可有效提高稳定性心绞痛患者的运动耐量周后行运动试验，实验证明法舒地尔可有效提高稳定性心绞痛患者的运动耐量运动持续时间运动持续时间060120180P0.01安慰剂安慰剂法舒地
24、尔法舒地尔 8周周44.0s172.1s运动至运动至S-T段压低的时间段压低的时间050100P0.01安慰剂安慰剂法舒地尔法舒地尔 8周周26.4s92.8s(s)(s)Vicari RM,et al.J Am Coll Cardiol.2005;46(10):1803-11.Rho激酶抑制剂激酶抑制剂抑制猪冠状动脉支架内内膜增生抑制猪冠状动脉支架内内膜增生支架前支架前支架后支架后4周后周后对照法舒地尔Rho激酶抑制剂激酶抑制剂抑制猪冠状动脉支架内内膜增生抑制猪冠状动脉支架内内膜增生Matsumoto Y,et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004;24
25、(1):181-6.Rho激酶与高血压激酶与高血压Rho激酶与高血压病有关的证据：激酶与高血压病有关的证据：高血压发病前高血压发病前Rho激酶活性增高激酶活性增高 血管反应性增高与血管反应性增高与Rho激酶异常激活有关激酶异常激活有关 Rho激酶参与高血压继发性病变（动脉硬化）激酶参与高血压继发性病变（动脉硬化）可治疗初期高血压可治疗初期高血压 防治高血压继发性血管病变防治高血压继发性血管病变Rho激酶与肾脏疾病激酶与肾脏疾病 Rho激酶激酶抑制剂可显著改善单侧输尿管阻塞引起的抑制剂可显著改善单侧输尿管阻塞引起的小管间质纤维化小管间质纤维化 长期应用长期应用Rho激酶抑制剂可预防和治疗高血压性
26、肾激酶抑制剂可预防和治疗高血压性肾小球硬化。小球硬化。Rho激酶激酶抑制剂的肾脏保护作用机制抑制剂的肾脏保护作用机制 抑制细胞外基质基因的表达抑制细胞外基质基因的表达 抑制单核细胞抑制单核细胞/巨噬细胞浸润巨噬细胞浸润 抑制氧化应激抑制氧化应激 抑制上调抑制上调eNOS基因的表达基因的表达Rho激酶与糖尿病激酶与糖尿病 Rho/Rho-kinase是胰岛素信号通路的环节，与胰是胰岛素信号通路的环节，与胰岛素抵抗的形成、胰岛素作用的调节及血糖的稳定岛素抵抗的形成、胰岛素作用的调节及血糖的稳定有关。有关。RhoA在成熟的胰岛在成熟的胰岛beta细胞表达，糖尿病小鼠模细胞表达，糖尿病小鼠模型胰岛型胰岛beta细胞细胞RhoA 表达显著增高表达显著增高 应用应用Rho激酶抑制剂，观察到激酶抑制剂，观察到insulin mRNA转录明转录明显增高，胰岛素启动子的活性显著增强显增高，胰岛素启动子的活性显著增强 Rho/Rho-kinase激活抑制糖尿病胰岛素表达激活抑制糖尿病胰岛素表达 抑制抑制Rho/Rho-kinase通路可以增加胰岛素基因的通路可以增加胰岛素基因的转录。转录。谢 谢 大 家
