1、二代测序（NGS）技术在肿瘤精准医疗中的应用典型的肺癌治疗策略I期II期III期Iv期TNM治疗策略原发肿瘤体积增大及侵犯淋巴结转移远处转移手术化疗靶向治疗晚期化疗与靶向治疗的抉择化疗靶向药靶点非特异性特异性杀伤疗效+毒副反应+价格相对较低较高化疗与靶向治疗的抉择靶向治疗口服，在家靶向药发展-肺癌JAMA.2014;311(19):1998-2006.doi:10.1001/jama.2014.3741肺癌靶向药物发展超过十年，晚期非小细胞肺癌中位生存期提高三倍以上，达到3.5年；生存质量也大幅提高靶向治疗与伴随诊断先检测EGFR突变先检测ALK融合吃靶向药前需要检测对应基因变异0.00.10
2、.20.30.40.50.60.70.80.91.00123456789101112131415Month:02468101214At risk:1692134887648425210331 病人存活比例(%)易瑞沙安慰剂中位生存期（月）5.65.11年存活率27%22%HR=0.89(0.78,1.03),P=.11N=1692,deaths=969Cox analysis,P=.0421.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0易瑞沙-安慰剂ISEL研究，所有病人同时入组，用易瑞沙无获益，但亚裔不吸烟肺腺癌患者获益靶向治疗与伴随诊断NCCN NSCLC 2014V2
3、以前，晚期转移NSCLC推荐EGFR及ALK检测n 前文提及：DNA携带了全套遗传信息，很稳定；但是总难免有差错的时候，基因的DNA片段某个地方序列发生变化，和原来的DNA不同了，这就是基因变异。什么是基因变异？基因变异有哪些类型？突变：某个碱基变成另一个了插入缺失：某段序列插入了几个或者丢失了几个碱基基因变异有哪些类型？n 我们主要需要了解的几种变异类型包括：点突变、插入/缺失、拷贝数变异（扩增、缺失）、重排（融合）拷贝数变异：人体内每个基因原始都是两份，如果某个基因超过了两份或者少于两份就是拷贝数变异重排：A基因的一段直接跟另外一个B基因融合在一起形成新的融合基因基因变异如何影响功能？蛋白
4、质的氨基酸序列最终是由DNA序列决定的，当DNA发生变异后很可能会影响蛋白质功能。但也不是一定会影响。（思考一下为什么）许多肿瘤的形成与基因变异有着密切的关联，了解基因突变有利于了解肿瘤的发生。基因变异有哪些类型？突变：某个碱基变成另一个了插入缺失：某段序列插入了几个或者丢失了几个碱基基因变异有哪些类型？n 我们主要需要了解的几种变异类型包括：点突变、插入/缺失、拷贝数变异（扩增、缺失）、重排（融合）拷贝数变异：人体内每个基因原始都是两份，如果某个基因超过了两份或者少于两份就是拷贝数变异重排：A基因的一段直接跟另外一个B基因融合在一起形成新的融合基因靶向治疗与伴随诊断NCCN NSCLC 20
5、14V2 以前，晚期转移NSCLC推荐EGFR及ALK检测靶向药伴随诊断靶向药伴随诊断传统分子诊断手段FISHIHCBRAC1/2 等点突变，插入缺失EGFR、HER2、BRAF、KRAS等基因的点突变、插入缺失SANGER测序检测ALK、ROS1、RET等融合，HER-2扩增等Arms-PCR检测融合（蛋白），HER-2、VEGFR扩增（高表达）等样本微量高侵入性肿瘤异质性液体活检对低丰度变异的高敏感性检测多基因与多变异形式的平行检测传统分子诊断手段的挑战NGSNGSNGS 高通量（千万序列/次）多基因平行测序 检测准确、灵敏采样提取基因组基因组片段化形成测序文库+。二代测序（NGS）一代测
6、序：Sanger法，单基因测序二代测序：高通量测序NCCN 指南关于NCCL靶向药伴随诊断建议检测基因型靶向药通用名生产厂商商品名英文名腺癌人群比例（中国）EGFR突变厄洛替尼瑞士罗氏特罗凯erlotinib42-52%吉非替尼英国阿斯利康易瑞沙gefitinib阿法替尼德国勃林格殷格翰GilotrifafatinibALK重排/融合克唑替尼美国辉瑞赛可瑞crizotinib6-7%色瑞替尼瑞士诺华ZykadiaCeritinibshiHer2突变曲妥珠单抗瑞士罗氏赫赛汀trastuzumab1%阿法替尼德国勃林格殷格翰GilotrifafatinibBraf突变威罗菲尼瑞士罗氏Zelbora
7、fvemurafenib2%达拉菲尼英国葛兰素史克TafinlardabrafenibMet扩增克唑替尼美国辉瑞赛可瑞crizotinib5%色瑞替尼瑞士诺华ZykadiaCeritinibshiRos1重排/融合克唑替尼美国辉瑞赛可瑞crizotinib1%色瑞替尼瑞士诺华ZykadiaCeritinibshiRet重排/融合卡博替尼美国ExelixisCometriqcabozantinib1%Kras突变K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用7%NGS检测优势-更多用药机会美国foundation medicine公司在文献中报道：FMI利用NG
8、S技术检测了2000个肿瘤FFPE样本，在76%的肿瘤组织中都检测到了actionable的变异，3倍于传统金标准；平均每个样本检测到3.06个变异，其中1.57个为actionable的变异。燃石的多基因平行检测，与传统检测方法相比，同样能在更大概率上发现多actionable驱动突变（多阳性）的案例平行检测优势-多阳性检出传统检测方法为什么检测不到多阳性1.逐项检测EGFR：ARMS检测ALK：FISH检测KRAS：ARMS检测ROS1,MET,HER2 2.标本用量大病理评估EGFR：ARMS检测ALK：FISH检测样本没了3.检测基因少突变丰度NCCN:EGFR和ALK检测可以并入多重
9、/二代（NGS）测序分子检测。NCCN强烈推荐比现有方法更高通量的分子检测，筛查商品化靶向药的靶点突变，或适当建议病人参加临床实验。多部指南对二代测序（NGS）方法的推荐ASCO将会根据临床经验，把更多地分子靶标列入检测范围。在标本有限的前提下，现有方法对每个分子单独检测将会非常困难。而新的检测方法（如NGS）可以进行多位点同时检测，在临床中对比传统方法有很大的优势。ESMO:多通道平行检测，例如二代测序技术（特指Panel检测组合），可同时分析多个可能的靶向药靶点变异，是一种节约成本和标本的检测方法。已有充分质控表明，这是一种适合临床使用的突变检测方法。强烈推荐u多基因平行检测-更精确的分子
10、分型，更多靶向用药机会u逐项检测 vs 平行检测：节约时间，不遗漏多阳性；u提示突变丰度，提供更多信息；u节约检测成本与样本用量；u基于捕获的NGS能覆盖基因全外显子，热点+罕见+未知变异位点u精准治疗首先要精准诊断NGS方法的优势NGS与精准医疗的发展-首先要精准诊断William Pao,Lancet Onc.2011v新分子分型不断被发现v精准分子分型-精准医疗v靶点不断增加与细分v需要多基因检测-明确分子分型v需要多种变异类型全覆盖v需要契合临床实际情况-肿瘤异质性/样本稀缺性美国NCIMATCH计划v3000名不同癌种患者vNGS检测143基因v20余种靶向药物v根据分子分型精准治疗
11、NGS在肿瘤精准医疗中的应用Part 1靶向药物的优势医生为何用NGS吃靶向药先伴随诊断NGS比传统伴随诊断优势精准医疗uNGS与肿瘤精准医疗uNGS的应用及产品线u燃石技术优势Outline临床检测样本来源组织血液手术活检：穿刺等其他：胸水等血浆白细胞产品线癌种产品名靶向药物用药指导基于组织肺癌朗克TM 朗康TM乳腺癌燃石贝康TM结直肠癌燃石凯康TM胃肠道间质瘤燃石吉康TM胃癌燃石盖康TM胰腺癌燃石帕康TM肾癌燃石瑞康TM泛癌种OncoscreenTM无创靶向药物用药指导基于血液ctDNA肺癌燃石朗清TM泛癌种燃石普清TM燃石靶向用药指导产品线下一个问题：检测哪些基因u告诉医生为什么要测这些
12、基因 要有临床意义u病人情况不一样：经济条件、能取得的样本 提供不同选择1.组织-朗克-8基因入选基因均有NCCN指南推荐，证据充分朗克靶向药物指导alectinibEGFR TKIEGFR TKI第二代EGFR-TKI 阿法替尼 EGFR/ERBB2/ERBB4EGFR TKIAZD9291获批，针对EGFR-TKI治疗进展T790M携带患者，TagrissoKRAS基因u 位于EGFR下游，正常时EGFR给信号才暂时激活往下游传递u 突变型KRAS导致蛋白持续激活u 此时即使无EGFR活化信号仍处于激活状态，导致细胞增殖失控。对EGFR的抑制可能失去作用。u 在NSCLC中突变率高，西方人
13、群肺腺癌约20-30%u 通常与其他驱动突变互斥u 有证据表明Kras基因突变与靶向药的耐药相关。u 深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后重要指标。KRAS基因检测临床意义医生可以得到什么信息？目标患者：1.肺癌初诊患者2.传统检测EGFR阴性患者产品目标群体产品优势1.入选基因均有NCCN指南推荐，证据充分2.NGS同时检测8个基因的突变、融合以及扩增等多种变异3.靶向药物治疗与基因突变对应明确，便于解读4.可检测1%的低丰度突变6.直销与入院合作等多种合作模式结合5.价钱合理，周期短7.已知+未知全覆盖，快速响应研究进展靶向药物靶点少数证据比较充分的化疗敏感位点组织样本NGS检测产
14、品-朗康-56基因 临床实验信息肺癌II/III期临床实验在研药物-入组其他癌种获批药物-跨适应症用药依据分子分型由医生做决策考虑疗效+毒副反应在标准治疗失败后；篮子试验：相同分子分型的不同癌种放一起做临床实验；代表：ALKoma，ALK在NSCLC,淋巴瘤、肾癌、神经母细胞瘤等均为驱动基因。正在进行中的克唑替尼A8081013临床试验（吴一龙）为什么测56基因哪些客户需要测56基因u 初诊：跟朗克差不多价格，多测很多基因，且节约标本量u 常规初诊阴性u 复发/耐药u 收集点数据，做做科研药物代谢及毒性相关基因（SNP）-化疗敏感性及毒副作用指导位点为什么这么少？跟靶向药不同，大部分没有非常充
15、足的证据及数据库支撑5-FU类药物化疗敏感位点u 5-FU类药物有哪些呢？氟尿嘧啶(化学名：5-FU)、希罗达（化学名：卡培他滨）、替加氟、卡莫氟（孚贝）、氟脲苷等。u 基因检测有据可查美国FDA明确指出：在使用5-FU，卡培他滨时，建议检测DPYD基因型。中国国家卫生部在新的临床检验项目目录中，也增列了5-FU用药指导的基因检测。血液检测产品-朗清u晚期；u无法穿刺/患者不愿意穿刺；u经济条件能承担；Heitzer et al.Genome Medicine 2013,5:73 朗清测的是什么？-ctDNA（循环肿瘤DNA）ctDNA检测的特点可在DNA水平上检出突变+融合NCCN指南明确推
16、荐的用药指导相关靶点全覆盖所有NSCLC中突变热点（用药指导相关与否）全覆盖大幅增加ctDNA检出敏感性代替组织活检进行用药指导进行治疗后复发转移监控比影像学更灵敏EGFR敏感性及抗药性突变ALK/ROS1/RET融合及抗药性突变MET 14号外显子可变剪切突变及扩增BRAF V600E等热点突变HER2 20号外显子插入突变肺癌-ctDNA panel 设计理念-朗清-168v 可准确检测0.2%的超低丰度突变；v 唯一可以在血液中检测融合的方法（ALK等）v IB-IIIA 的检测敏感性60%v IIIB-IV 的检测敏感性 85%v 所有样本的特异性 98%朗清的主要特点组织测出来的变异
17、，血液能否检测出来推广策略目标患者：1.晚期肺癌初诊患者（无法穿刺或者手术）2.治疗后（用药或手术）的复发监测3.靶向药物的耐药机制4.科研目标科室：呼吸科、肿瘤内科Sample from internal data 用药指导肺腺癌晚期，传统检测（EGFR，ALK，ROS1，MET）阴性，病人只能计划接受化疗，经医生推荐试试看的心态送检了朗清ctDNA检测。BLPR结果提示：根据cMET 14外显子点突变结果服用克唑替尼，病人PR，该位点在血液中的变异丰度降低，提示治疗效果。Sample from internal dataSample from internal data 通过通过ctDNA
18、检测对病程实现动态监控检测对病程实现动态监控肺腺癌晚期，经I代EGFR-TKI治疗后耐药，后一直服用III代EGFR-TKI，全身其他病灶PR，但肝区肿块PD，4/2经第一次ctDNA检测发现ALK融合，后经克唑替尼治疗3个月后血中ALK融合消失，近期ctDNA开始检出EGFR T790M与C797S突变4.26.36.307.278.17T790M出现ALK融合消失C797S出现血液检测开发方向NCCN指南明确推荐8-基因热点区域超深度测序液体活检初诊无法穿刺的患者有针对性的用药指导168-基因TCGA热点突变区域超深度测序液体活检晚期患者用药后或手术患者术后复发监测靶向治疗耐药机制NGS在
19、肿瘤精准医疗中的应用Part 1靶向药物的优势医生为何用NGS吃靶向药先伴随诊断NGS比传统伴随诊断优势Part 2组织样本血液样本燃石提供哪些NGS产品组织8/56为什么放这些基因；适用的患者；血液168血检优势、产品特性精准医疗uNGS与肿瘤精准医疗uNGS的应用及产品线u燃石技术优势OutlineNGS测肿瘤的公司那么多，为什么要选燃石燃石技术有什么优势吗？基于捕获Capture基于多重PCRAmpliconIlluminaLife建库实验方法测序仪器测序深度NGS在肿瘤伴随诊断领域的方法选择1000X300-500X决定能测什么决定测序数据准不准决定变异能不能被检出EGFR exon1
20、9EGFR exon21KRAS exon2多重PCR针对已知位点设计特异性引物测序优势1.方便，建库步骤少，时间短；2.起始量低（2-6 FFPE）Amplicon 技术原理（了解）Amplicon 技术原理（了解）EGFR exon19EGFR exon21KRAS exon2多重PCR测序缺陷1.扩增效率不一致-无法检测拷贝数变异，无法报告突变丰度；2.仅检测热点区域；3.仅能RNA水平检测融合EGFR Gene AGene BKRAS Gene C片段化，加入相同接头探针杂交目的基因全外显子EGFR 全外显子KRAS 全外显子Capture 技术原理（了解）捕获相同引物扩增测序不足1.
21、步骤多；2.起始量要求高一些；优势1.扩增效率一致，可以检测拷贝数变异及突变丰度；2.全外显子-可检测所有变异位点；3.DNA水平检测融合Capture 技术原理（了解）Amplicon vs Capture-检测变异类型的差别变异类型点突变插入缺失融合扩增Amplicon仅热点区域突变仅通过RNA检测组织样本血液无法检测融合XCapture检测所有已知+未知突变通过DNA样本检测所有融合事件可检测并提供扩增倍数值代表基因EGFR,KRAS,BRAFEGFR,ERBB2ALK,ROS1,RETMET,ERBB2注：基于Amplicon无法报告突变丰度IlluminaLife测序仪器NGS在肿瘤
22、伴随诊断领域的方法选择决定测序数据准不准illuminaMiseq，通量适合，数据质量好，非常适用于临床。Nextseq 500 集合高通量与台式测序仪的简约，通量灵活（中、高通量两种模式）；各厂家主流测序仪-Thermo fisher-LifeLife-Proton运行时间短，价格低适用于panel或外显子组测序Life-PGM运行时间更短，通量低适用于小基因组等Illumina 测序平台基于光信号的测序原理Life 测序平台基于电信号的测序原理Illumina vs life边合成边测序的方法提供了极高的准确性，但牺牲了部分测序时间。半导体测序的方法速度快，但由于微电流的干扰，测序无法避免
23、随机的Indel较多以及准确率低的问题。Illumina MiseqIllumina Nexseq 500Life PGMLife Proton通量6G40/120G2G10G数据质量Q30Q30Q17Q17测序周期24 h24 h4 h4.5+4+4 h分析开源开源自动化的黑匣子优点小结数据质量高可精确检测低丰度突变与插入缺失可进行个性化定制化分析通量小灵活性高测序周期短无需生物信息学支持适用肿瘤组织与ctDNA体细胞突变检测无创产前或胚系点突变检测Illumina life测序仪比较Q30：0.1%错误率Q17：1.5%错误率测序深度：某位点被测了多少次3.测序深度AA.参考基因组序列测序
24、得到的序列GAAGAAGA1000条=1000X此位点测序深度1000X，A是野生型，G是突变型例：EGFR 21E什么叫突变丰度突变丰度=4/14=28.5%未突变的DNA来自正常组织或肿瘤中的其他亚克隆EGFR L858组织需要多少测序深度？平均测序深度检测到突变的概率丰度为20%的突变丰度为10%的突变丰度为5%的突变丰度为2%的突变平均测序深度500X可以观测到95%的5%低丰度突变事件500X0.95为何选择1000X测序深度？1.1000X的测序深度能保证大部分低丰度变异不被漏检，不造成假阴性，不使病人失去靶向治疗机会；2.很多重要的驱动突变在组织检测中突变丰度很低，临床上需要较高
25、测序深度以增加低频变异的检出；Nature Medicine,6 April 2014;doi:10.1038/nm.3519.血液检测需要多少X？-国际顶尖杂志数据CAPP-Seq技术待测样本DNA基于捕获目的区域富集超深度测序数据分析测序深度10000报告解读1.包含 COSMIC+TCGA数据已知驱动基因+文献报道的变异区域2.基因共139个，包含融合检测区域后Panel大小125kbu CAPP-Seq检测突变丰度下限非常灵敏，适用于ctDNA检测，同时对于NSCLC人群变异的覆盖度很高u 检测成本合理，适于临床应用u 不仅可应用于NSCLC，未来可能应用于携带不同肿瘤基因型的各种实体
26、瘤u II-IV期的NSCLC中100%能检测到ctDNA变异u I期的NSCLC中50%能检测到ctDNA变异u 96%的病人都可以检测到变异，最低检测到0.02%的变异u 平均每个样本检测到4个变异结果与文章意义血液需要多少X？在ctDNA中，来自正常组织的DNA量大大增多，因此朗清需要比朗康更深的深度和更精致的分析方法来甄别假阳性与真阳性EGFR L858思考一下：为什么血液中很难检测到扩增？低丰度变异检测对于临床的意义u 为什么要测这么深？u 低丰度突变对于临床有意义吗？ctDNA在cfDNA中占比很低，需要更高的测序深度，才能保证超低丰度突变能被检测出来，提高敏感度，降低假阴性的发生
27、。测序深度过浅会造成大量假阴性，全阴报告的比例也会变得很高，比起测序深度增加带来的成本，假阴性的报告会使病人浪费更多钱和组织不太一样，只要血液中检测出了驱动变异，说明在组织中肿瘤负荷已经比较大了，才会释放ctDNA片段到血液中。目前没有数据库及随访资料支持。但从燃石做过的几百例配对组织血液来看，只要血液中能检测出来的，在组织中基本都有百分之几十的突变丰度（经验值）肿瘤检测优选平台Captureillumina+测序准确度高；自动化信息分析平台 已知+未知变异位点；可检测拷贝数变异；可提示突变丰度；DNA水平检测融合；组织1000X，血液10000X 更大概率检出低丰度突变测序深度肿瘤靶向药物指
28、导panel统一特性u 基于NGS平台，测序深度达1000X，可检测1%丰度的突变；u 覆盖对应癌种已获批靶向药物/在研药物及所有其他癌种获批靶向药物，全面筛查靶向治疗可能；u 平行检测多靶点基因全外显子，覆盖已知与未知变异检测；u 完全基于DNA样本即可检测同时检测点突变、插入/缺失、融合/重排、拷贝数变异等多种变异类型v 测序深度10000Xv 可准确检测0.2%的超低丰度突变；v 唯一可以在血液中检测融合的方法（ALK等）v IIIB-IV 的检测敏感性 85%v 所有样本的特异性 98%朗清血液检测panel的主要特点NGS在肿瘤精准医疗中的应用Part 1靶向药物的优势医生为何用NGS吃靶向药先伴随诊断NGS比传统伴随诊断优势Part 2组织样本血液样本燃石提供哪些NGS产品组织8/56为什么放这些基因；适用的患者；血液168血检优势、产品特性Part 33个要素为什么要选择燃石NGSCapture检测变异最全；Illumina测得准；测序深度国际顶尖标准；技术层面的优势；更适用于解决临床需求精准医疗
