1、PCR原理+流程乌桕DNA提取方法国内外相关文章Page 2 PCR原理n 聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）(又称：多聚酶链式反应），聚合酶链式反应，其英文Polymerase Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。Page 3特点n具有特异性强n灵敏度高n操作简便n省时等特点。Page 4用途n 可用于基因分离n 克隆和核酸序列分析等基础研
2、究n 还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方Page 5n(1)扩增各种蛋白的基因：n(2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列n(3)用于分子进化和种系发育的研究，研究其分子进化及种系发育是很有用的n4)分析和诊断遗传性疾病n(5)对人类HLA基因的多肽性分析，对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。Page 6主要过程nPCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成Page 7 模板DNA的变性n模板DNA经加 热至92左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；Page 8模板D
3、NA与引 物的退火(复性)n模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；Page 9引物的延伸n DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。Page 10nPCR的反应动力学 n PCR的三个反应
4、步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。Page 11PCR扩增物n PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两
5、部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物
6、片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。Page 12 所需材料n 1.试剂和溶液n(1)10 PCR缓冲液n 500 mM 氯化钾n 100 mM Tris-Cl(室温时pH 8.3)n 15 mM 氯化镁n(2)10 mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液含有所有四种dNTPs(pH 8.0)Page 13n 3)耐热的DNA 聚合酶：n Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有53 DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35 外切酶活性。n rTth DNA聚合酶
7、是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有53DNA 聚合酶和35外切酶(校正)的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。Page 14n(4)琼脂糖凝胶n(5)10 M的上游和下游引物n(6)DNA模板n(7)对照DNA(含有靶序列的DNA)n(8)DNA长度标准参照物Page 152.设备n(1)0.2 ml PCR扩增管Page 16(2)可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪)Page 17实验操作n 1、按以下次序，将各成分加入0.2 ml灭菌
8、扩增管中：n 成分 体积 终浓度n 10 PCR缓冲液 5 l 1 10 mM n dNTP溶液(pH 8.0)1 l 每种0.2 mMn 10 M 上游引物 2.5 l 0.5 Mn 10 M 下游引物 2.5 l 0.5 Mn 5单位/l 耐热DNA聚合酶 0.5 l 2.5单位n DNA模板 1-10 l 1 pg-1gn 消毒的蒸馏水 至50 lPage 18n2将小管中的混合物混匀n并加入50 l矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。n3盖紧小管，短暂离心，以使PCR混合物沉于管底。Page 19n 4小管在温度循环器(PCR仪)中94C温育3分钟，以使模板DNA完全变性。Page 20
9、n5.按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增：n变性 94C 30秒n退火 55C 30秒n延伸 72C 1分钟/1 kbPage 21n672C温育PCR样本10分钟，可于4C维持。样本可贮存于-20C直至使用。n7采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。Page 22 电泳Page 23 PCR荧光定量Page 24 结果Page 25Page 26植物DNA提取方法n1.CTAB法n2.SDS法n3.高盐法Page 27乌桕DNA提取方法n1.CTAB法n2.SDS法Page 28 CTAB法提取植物基因组DNAn 这种方法是由M
10、urray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。n 最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。Page 29一 材料、试剂和仪器n1 材料 n新鲜的组织材料或-80冻存的材料n叶子和种子的胚乳为材料Page 302 试剂n(1)2CTAB溶液n CTAB(W/V)2%n Tris-HCL
11、100MMOL/L PH8n EDTA 20MMOL PH 8n NACL 1.4MOL/Ln PVP 1%n 灭菌备用Page 31n(2)氯仿/异戊醇（24:1）n(3)RNaseA 10mg/mln(4)乙醇或异丙醇(5)-巯基乙醇n（6）氯仿/异戊醇（25/24/1）n（7）70%乙醇Page 323.仪器:a、离心机Page 33b、恒温水浴Page 34c、电泳装置Page 35实验步骤n 1.在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20 l-巯基乙醇,65预热。n 2、嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉
12、末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。Page 36n 3.加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。n 4.向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置3720-30min。5.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 min或-80放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。
13、n 6.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。n 7.0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。Page 37 SDS法n 原理：SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。Page 38 试剂n(1)提取缓冲液Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）nEDTA 50mmol
14、/L（pH8.0）nNaCl 500 mmol/Ln灭菌后加-巯基乙醇至10 mmol/LPage 39n(2)裂解液20%SDSn(3)高盐溶液5mol/L KAcn(4)RNaseA 10mg/mln(5)异丙醇n(6)灭菌ddH2O或TEPage 40 实验程序n 1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中,轻轻混匀。n 2、向管中加入50L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65保温10min，并不时摇动。n 3、加入150
15、L 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。Page 41n 4、4,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20沉淀30 min。n 5、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。n 6、加入1/10体积的RNaseA，37保温20min，除去RNAn 7、CI抽提后，加2V乙醇，-20沉淀30 min。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。n 8、用400L 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。Page 429、电泳检测完
16、整性。n 采用琼脂糖凝胶电泳方法，观察电泳图来判断DNA完整性n 若：电泳图呈现干净、光滑的单一一条带，没有拖尾现象，则说明DNA的完整性很好。可用于后续PCR分子生物学操作。n 若：电泳图有拖尾现象，不止单一一条带，则DNA完整性不是很好，用于后续实验操作效果较差。DNA完整完整性良好性良好Page 43 国内外相关文章Page 44 乌桕基因组DNA提取方法研究n 张帅 王晓光 邓先珍 罗治建 程军勇 卢小三n【摘要】：以改良CTAB法和SDS法提取乌桕基因组DNA,对提取条件进行了正交试验,优化出乌桕基因组DNA提取的适宜条件,采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳分析及限制性内切酶进行了
17、检测。结果表明:改良CTAB法的A1、B2、C2、D2组合提取的基因组DNA纯度高,无拖尾现象,OD260/280值在1.82.0,OD260/230在2.0。Page 45n【作者单位】：华中农业大学;湖北省林业科学研究院;n【分类号】：S792.99cqvip/Read/Read.aspx?id=32358846材料：乌桕嫩叶采自湖北省九峰山，种子采自湖北省英山县30年生乌桕优叔Page 46n 方法：采用若干乌桕叶片和种子，采用改良的CTAB法和SDS发分别提取乌桕基因组DNA，并对提取液分别进行紫外光分光光度计检测、检测糖凝胶电泳检测、限制性内切酶EcoRI检测n 结果：在条件相同的情况下，使用改良的CTAB法提取的乌桕嫩叶和种子DNA泳带平直清晰，亮度高，呈块壮，无明显拖尾痕迹，点样孔较干净，采用SDS发提取的DNA泳带呈块状，点样孔处残留少量杂质。纯度不高。n 适量的-ME（坏）、PVP（好）都对乌桕的DNA 提取效果有影响
