1、 透射电镜是利用电子束作为照明源，通过几级电磁透射电镜是利用电子束作为照明源，通过几级电磁透镜放大成像于荧光屏上，透镜放大成像于荧光屏上，因而因而电子束本身的穿透力弱，电子束本身的穿透力弱，在电镜观察之前，必须把样品切成在电镜观察之前，必须把样品切成700700埃埃或更薄的切片；或更薄的切片；或把样品或把样品(细菌、病毒、单细胞之类细菌、病毒、单细胞之类)制成悬液；或把样制成悬液；或把样品（如较硬样品）的表面制成复型等品（如较硬样品）的表面制成复型等，我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品制备技术。制备技术。用超薄切片法，可得到用超薄切片法，可得到2525
2、埃埃左右的分辨率；左右的分辨率；同电镜本身早已达到同电镜本身早已达到2-32-3埃埃的分辨本领相比，还的分辨本领相比，还有相当大的有相当大的“差距差距”。这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发现和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的现和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的制样技术。制样技术。在电镜技术中，有两种分辨率在电镜技术中，有两种分辨率：一种是电镜本身的分辨率一种是电镜本身的分辨率，二二是样品制备上的分辨率是样品制备上的分辨率，同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使细节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。
3、细节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟练地掌握制样技巧是极为重要的一环。练地掌握制样技巧是极为重要的一环。石腊切片机的最高水平可以把片子切到石腊切片机的最高水平可以把片子切到1-21-2微微米。米。现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求途径。途径。目前的超薄切片机目前的超薄切片机可以以连续切片的方式把可以以连续切片的方式把一个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。一个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。目前使用的超薄切片机主要是热膨胀式（瑞典目前使用的超薄切片机主要是热
4、膨胀式（瑞典LKBLKB公司制造）和机械推进式（美国的公司制造）和机械推进式（美国的Porter-BlumPorter-Blum）两种，）两种，的为代表的为代表，与此同时，许多固定、包埋和染色技术的发展和与此同时，许多固定、包埋和染色技术的发展和应用，使超薄切片应用，使超薄切片;去成为样品制备中最普遍，而又最去成为样品制备中最普遍，而又最基本的方法。基本的方法。超薄切片制样过程同石腊切片过程大体相似，它超薄切片制样过程同石腊切片过程大体相似，它分为分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片等等几个环节。几个环节。超薄切片技术超薄切片技术 是为透射电子显
5、微镜观察提供是为透射电子显微镜观察提供超薄样品的专门技术。它是生物学中研究细胞、组织超微超薄样品的专门技术。它是生物学中研究细胞、组织超微结构常用的技术，也是生物学中其它电子显微镜技术，如结构常用的技术，也是生物学中其它电子显微镜技术，如电镜放射自显影、电镜组织化学以及免疫电镜技术等关键电镜放射自显影、电镜组织化学以及免疫电镜技术等关键性的技术。性的技术。这种技术在生物学的发展过程中占据重要的位置，目这种技术在生物学的发展过程中占据重要的位置，目前有关生物体的各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是前有关生物体的各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是这种技术提供的。这种技术提供的。超薄切片术超薄切片
6、术 是最基本的透射电镜样品制备技术。需要借助是最基本的透射电镜样品制备技术。需要借助超薄切片机制备样品；切片的厚度小于超薄切片机制备样品；切片的厚度小于100100毫微米毫微米（一般在（一般在30-7030-70毫微毫微米米）；被广泛用于揭示样品的超微结构。）；被广泛用于揭示样品的超微结构。超薄切片术超薄切片术 是电镜细胞化学、免疫电镜、电镜放射自显影、是电镜细胞化学、免疫电镜、电镜放射自显影、X X射线微区元素分析等技术的基础，是研究生物医学样品的超微结构射线微区元素分析等技术的基础，是研究生物医学样品的超微结构及其功能的有力工具。及其功能的有力工具。长度单位长度单位的概念的概念:光学显微术
7、中常用的长度单位是光学显微术中常用的长度单位是：“微米微米”（）,电镜是研究电镜是研究超微观物体的工具超微观物体的工具,其分辨能力比普通显微镜大其分辨能力比普通显微镜大10001000倍以上。倍以上。在电子显微术中在电子显微术中,通常用通常用“埃埃”（A A）或毫微米（）或毫微米（nmnm或或mmmm）来表示。）来表示。它们之间的换算关系如下它们之间的换算关系如下：1 1毫米毫米（mmmm）=1000=1000微米微米（）1 1微米微米（）=1000=1000毫微米毫微米（nmnm或或mumu）1 1毫微米毫微米（nmnm或或mumu）=10=10埃埃（A A）1 1毫米毫米=10=103 3
8、微米微米=10=106 6毫微米毫微米=10=107 7埃埃超薄切片术超薄切片术一般厚度在一般厚度在10-10010-100毫微米的切片称为毫微米的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术，叫做超薄切片技术。超薄切片，制作这种切片的技术，叫做超薄切片技术。超薄切片过程一般与光学显微镜的石腊切片过程原则超薄切片过程一般与光学显微镜的石腊切片过程原则上基本相似，也包括上基本相似，也包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色聚合、切片和染色等几个环节（图）。等几个环节（图）。超薄切片操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，超薄切片操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，
9、而且所用的试剂及配制方法也有所不同。而且所用的试剂及配制方法也有所不同。染色目的将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差超薄切片技术的应用超薄切片超薄切片分为分为两大类两大类：1 1、普通超薄切片术普通超薄切片术2 2、半薄切片术半薄切片术。普通超薄切片术普通超薄切片术指不需要特殊的冷冻条件指不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。的常规包埋切片技术。普通超薄切片的每一部分都是重要环节，都普通超薄切片的每一部分都是重要环节，都直接与样品的质量相关，而样品质量的优劣又与直接与样品的质量相关，而样品质量的优劣又与观察结果密切相关；为了得到可靠和满意的切片观察结果密切相关；为了得到可靠和满意的切片
10、结果，需要步步谨慎和认真。结果，需要步步谨慎和认真。（一）、取材和固定（一）、取材和固定（二）、脱水和浸透（二）、脱水和浸透（三）、包埋和聚合（三）、包埋和聚合（四）、超薄切片（四）、超薄切片（五）、电子染色（五）、电子染色（一）、取材和固定（一）、取材和固定1 1、操作原则：、操作原则：取材和固定要遵照四大原则：取材和固定要遵照四大原则：“准准”、“快快”、“轻轻”、“优优”的操作原则。的操作原则。准：准：样品块一般约有样品块一般约有1 1mmmm3 3，要求取材的部位要准。，要求取材的部位要准。快：快：动物被处死之后，机体内的组织细胞就脱离了正常的生存环境，细动物被处死之后，机体内的组织细
11、胞就脱离了正常的生存环境，细 胞的自溶作用会导致其坏死，致使超微结构发生改变，为了把这种胞的自溶作用会导致其坏死，致使超微结构发生改变，为了把这种 损伤减到最小，处死动物后，要争取在损伤减到最小，处死动物后，要争取在1 12 2分钟内完成取材分钟内完成取材(超过超过5 5 分钟的样品最好不要再用分钟的样品最好不要再用)，并立即把样品浸入固定液中。，并立即把样品浸入固定液中。一、取材和固定一、取材和固定轻：轻：样品的超微结构脆弱，为防止各种人为的损伤，样品的超微结构脆弱，为防止各种人为的损伤，在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的 解剖工具，操作尽量
12、轻巧，以避免挤压。解剖工具，操作尽量轻巧，以避免挤压。优：优：优质的固定是关键环节之一，遇到特殊情况时最优质的固定是关键环节之一，遇到特殊情况时最 好根据样品本身的要求，经过反复实验选用最佳好根据样品本身的要求，经过反复实验选用最佳 的固定条件。的固定条件。一、取材和固定一、取材和固定2 2操作方法：操作方法：(1)(1)动物组织块处理方法：动物组织块处理方法：用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料，立即浸入用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料，立即浸入2 2一一5 5戊二醛进行前固定，并用锋利的双面刀片将样品剁成戊二醛进行前固定，并用锋利的双面刀片将样品剁成1 1mmmm3
13、 3的碎块，的碎块，于于44固定固定1 1小时以上。小时以上。(如果需要更长时间的前固定，需适时更换新鲜的如果需要更长时间的前固定，需适时更换新鲜的固定液，并尽可能在固定液，并尽可能在44冰箱中保存。冰箱中保存。)接着用缓冲液冲洗处理接着用缓冲液冲洗处理10103030分分钟，以洗去前固定液，然后在钟，以洗去前固定液，然后在44下，用下，用1 1四氧化锇四氧化锇(即锇酸即锇酸)进行后固进行后固定定l l一一2 2小时。小时。一、取材和固定一、取材和固定(2)(2)单细胞的处理方法：单细胞的处理方法：一般指人工培养的细胞（包括悬浮或贴壁生长），对一般指人工培养的细胞（包括悬浮或贴壁生长），对贴壁
14、生长的细胞需要先用贴壁生长的细胞需要先用0.50.5胰酶处理若干分钟，或用胰酶处理若干分钟，或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落。先离心，薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落。先离心，10001000g g，5 51010分钟，弃上清液，加入缓冲液后再离心分钟，弃上清液，加入缓冲液后再离心1 1次（条件同前），次（条件同前），弃上清液。弃上清液。一、取材和固定一、取材和固定3 3、固定的种类、固定的种类按固定液的成分划分可分为：按固定液的成分划分可分为：1 1）单固定）单固定 就是只用戊二醛或四氧化锇固定，一般用于单细胞样就是只用戊二醛或四氧化锇固定，一般用于单细胞样 品或易渗透的样品。品或易渗透的样品。
15、2 2）双固定）双固定 指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化锇作指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化锇作 后固定，这种方法效果好，应用广泛。后固定，这种方法效果好，应用广泛。3 3）多重固定）多重固定指联合使用三种以上的固定剂，以达到取长补短的目指联合使用三种以上的固定剂，以达到取长补短的目 的。可以根据样品的需要进行选择。的。可以根据样品的需要进行选择。一、取材和固定一、取材和固定按固定方式则可分为：按固定方式则可分为：1 1、原位固定、原位固定、2 2、灌流固定、灌流固定、3 3、浸没固定等。、浸没固定等。其中浸没固定最常用，但对不易解剖的组织和对缺其中浸没固定最常用，但对不易
16、解剖的组织和对缺血、缺氧等敏感的组织，如：心脏、肺、脑等，用原位血、缺氧等敏感的组织，如：心脏、肺、脑等，用原位固定和灌流固定则可提高固定的质量。固定和灌流固定则可提高固定的质量。一、取材和固定一、取材和固定1 1）原位固定）原位固定是指解剖过程之中，在摘取所需器官之前，即器是指解剖过程之中，在摘取所需器官之前，即器官还在原位时，先用醛类固定液冲洗其外面的血液等杂质，并不断抽官还在原位时，先用醛类固定液冲洗其外面的血液等杂质，并不断抽掉混浊液，同时用新鲜的预冷的固定液反复冲洗，直到组织适度变硬。掉混浊液，同时用新鲜的预冷的固定液反复冲洗，直到组织适度变硬。这种固定方法的作用是，在保证器官本身血
17、供的同时对器官进行整体这种固定方法的作用是，在保证器官本身血供的同时对器官进行整体的预固定。然后取下所需材料，依次浸入的预固定。然后取下所需材料，依次浸入3 3戊二醛进行前固定和戊二醛进行前固定和1 1四氧化锇进行后固定。四氧化锇进行后固定。2 2）灌流固定）灌流固定是指将固定液注入血管，通过循环作用渗透到器是指将固定液注入血管，通过循环作用渗透到器官组织的内部，使其得到充分的预固定，再解剖取下所需组织，剁成官组织的内部，使其得到充分的预固定，再解剖取下所需组织，剁成碎块，做常规双固定。碎块，做常规双固定。一、取材和固定一、取材和固定4 4、缓冲液的选择和配制、缓冲液的选择和配制 为了在固定过
18、程中维持细胞本身的为了在固定过程中维持细胞本身的pHpH值和渗透压，值和渗透压，以防止因样品收缩和膨胀等引起超微结构的改变，需用以防止因样品收缩和膨胀等引起超微结构的改变，需用适当的缓冲液来配制固定液。适当的缓冲液来配制固定液。一般常用缓冲液的一般常用缓冲液的pHpH在在7.0-7.47.0-7.4之间，但根据样品的之间，但根据样品的需要，也可以调到需要，也可以调到6.86.8以下或以下或7.67.6以上。以上。一、取材和固定一、取材和固定缓冲液的种类缓冲液的种类:1 1、磷酸盐缓冲液，、磷酸盐缓冲液，2 2、二甲胂酸盐缓冲液，、二甲胂酸盐缓冲液，3 3、醋酸巴、醋酸巴比妥钠缓冲液，比妥钠缓冲
19、液，4 4、三甲基毗烷缓冲液等。、三甲基毗烷缓冲液等。最常用的最常用的缓冲液缓冲液是：是：1 1、磷酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液2 2、二甲胂酸钠缓冲液、二甲胂酸钠缓冲液一、取材和固定一、取材和固定1 1磷酸钠缓冲液：磷酸钠缓冲液：应用广泛。这种缓冲液有多种配方。应用广泛。这种缓冲液有多种配方。2 2二甲胂酸钠缓冲液：二甲胂酸钠缓冲液：有异味和毒性，配制和使用时要格外小心，最好用通风橱。有异味和毒性，配制和使用时要格外小心，最好用通风橱。它不它不易被污染，在易被污染，在44冰箱中能保存较长的时间。这种缓冲液对细胞中的生冰箱中能保存较长的时间。这种缓冲液对细胞中的生化活性具有良好的稳定作用，化活性具
20、有良好的稳定作用，常用于免疫电镜和电镜细胞化学样品的常用于免疫电镜和电镜细胞化学样品的制备。制备。迅速有效的固定是获取最佳超微结构的重要条件之一。迅速有效的固定是获取最佳超微结构的重要条件之一。一、取材和固定一、取材和固定5 5、固定液的选择和配制、固定液的选择和配制 固定的作用固定的作用:是阻止细胞自溶、稳定细胞的化学成分和超微结是阻止细胞自溶、稳定细胞的化学成分和超微结构。因此选择渗透力强、效果好的固定液是关键所在。构。因此选择渗透力强、效果好的固定液是关键所在。常用的固定方法：常用的固定方法：双重固定双重固定或或多重固定。多重固定。可以通过对样品的实际观察，来判断固定的效果和选择适宜的固
21、可以通过对样品的实际观察，来判断固定的效果和选择适宜的固定剂。定剂。一、取材和固定一、取材和固定良好的细胞的超微结构在电镜下观察具备的特征：良好的细胞的超微结构在电镜下观察具备的特征：一、取材和固定一、取材和固定细胞器细胞器形态特征形态特征细胞质膜三层结构清晰，没有断裂，层间隙基本均匀细胞质基质微粒均匀密布，没有空白区域粗面内质网腔呈扁平状，上面附着核糖核蛋白体颗粒线粒体外周双层膜和内嵴完整，无膨胀和收缩，基质致密，无空白区域细胞核双层膜完整，显示核膜孔，膜间隙均匀，核染色质浓密多种固定液如多种固定液如:醛类固定液醛类固定液，高锰酸钾固定液高锰酸钾固定液，四氧化锇固定液四氧化锇固定液等。等。一
22、、取材和固定一、取材和固定1 1、戊二醛、戊二醛 (C C5 5H H8 8O O2 2)：特点：特点：最常用的固定液。最常用的固定液。具有渗透快、能良好地具有渗透快、能良好地保存结构、使用条件较随意，因而适用范围广。这些特保存结构、使用条件较随意，因而适用范围广。这些特长取决于戊二醛本身的分子结构，它的单体分子小，穿长取决于戊二醛本身的分子结构，它的单体分子小，穿透力强，对数毫米的组织块也具良好的固定效果。透力强，对数毫米的组织块也具良好的固定效果。一、取材和固定一、取材和固定 戊二醛戊二醛是通过交联作用稳定细胞的结构的，对细是通过交联作用稳定细胞的结构的，对细胞膜系统、细胞骨架系统、糖原、
23、核蛋白和细胞基质的胞膜系统、细胞骨架系统、糖原、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。又因它具有两个醛基，所以能快速达到固定效果较好。又因它具有两个醛基，所以能快速达到良好的固定。良好的固定。用戊二醛固定时，溶液的温度允许在用戊二醛固定时，溶液的温度允许在44至室温之间，至室温之间，固定的时间短可几分钟至几十分钟，长可达几日，甚至固定的时间短可几分钟至几十分钟，长可达几日，甚至数周，所以常用于样品的前固定、临床病理速检固定和数周，所以常用于样品的前固定、临床病理速检固定和野外作业固定等。野外作业固定等。一、取材和固定一、取材和固定固定剂戊二醛（醛基和氨基反应）四氧化锇（锇与双键螯合）适合保存：适合保
24、存：蛋白质，核酸，多糖蛋白质，核酸，多糖不适合保存：不适合保存：脂类脂类分子量较小，渗透较快分子量较小，渗透较快（两步：戊二醛+锇酸）前固定：戊二醛固定液（2.5%-4%）中4 冰箱12h(中间0.5-1h可取出修块)后固定：锇酸固定液（1%）中4 冰箱或室温1h 固定液使用磷酸缓冲液配制而成，使用磷酸缓冲液可减少因组织渗透压改变造成的变形。固定液是样品的40倍 商品戊二醛呈浅黄色，商品戊二醛呈浅黄色，pH4.5pH4.55.05.0，最好，最好棕色瓶在棕色瓶在44条件下避光保存。条件下避光保存。当戊二醛的颜色变至深黄，当戊二醛的颜色变至深黄，pHpH降至降至3.53.5以以下时，说明已失效，
25、不宜再用下时，说明已失效，不宜再用。一、取材和固定一、取材和固定 为了维持样品的生理渗透压，使用戊二醛时常用缓冲为了维持样品的生理渗透压，使用戊二醛时常用缓冲液配制成液配制成2 2一一3 3，但对于有特殊要求的样品，可以在，但对于有特殊要求的样品，可以在1 1一一5 5之间选择。建议最好在临用之前配制新鲜的固定之间选择。建议最好在临用之前配制新鲜的固定液，以提高效力。配制方法如下：液，以提高效力。配制方法如下：戊二醛固定液的配制（以市售戊二醛固定液的配制（以市售 25的戊二醛为例的戊二醛为例）固定液浓度固定液浓度 取取 25戊二醛（戊二醛（mL）用缓冲液用缓冲液（0.1mol/L）加至总量加至
26、总量（mL）2 8 100 3 12 100 4 16 100 （使用棕色瓶，并保存在 4冰箱中）一、取材和固定一、取材和固定2 2、甲醛：甲醛：甲醛分子量较小。在组织中渗透快。固定迅速。单甲醛分子量较小。在组织中渗透快。固定迅速。单独使用时。保存超微结构的效果较差。但能保存某些酶独使用时。保存超微结构的效果较差。但能保存某些酶的活性。在电镜细胞化学中常采用。的活性。在电镜细胞化学中常采用。在一般样品固定时。有时甲醛与戊二醛混合使用效在一般样品固定时。有时甲醛与戊二醛混合使用效果较好。果较好。一般市售的甲醛中含有抗聚合的甲醇。影响固定效一般市售的甲醛中含有抗聚合的甲醇。影响固定效果。因此电镜样
27、品使用的甲醛需用多聚甲醛粉末在使用果。因此电镜样品使用的甲醛需用多聚甲醛粉末在使用前自行配制。前自行配制。一、取材和固定一、取材和固定配制配制20%20%甲醛原液方法：甲醛原液方法：称称3030克多聚甲醛粉末（先用乳钵研细再称），放入克多聚甲醛粉末（先用乳钵研细再称），放入装有约装有约130130毫升去离子水的烧杯中，加热至毫升去离子水的烧杯中，加热至60-7060-70，边，边搅拌边加入搅拌边加入1 1N NaOHN NaOH 10-20 10-20滴，至溶液透明，以上约需滴，至溶液透明，以上约需半小时。冷却后过滤，沉淀不到半小时。冷却后过滤，沉淀不到1%1%。然后加入去离子水。然后加入去离
28、子水至至150150毫升，放在毫升，放在4 4冰箱内备用。冰箱内备用。一、取材和固定一、取材和固定 3 3多聚甲醛多聚甲醛 (CHCH2 2O)O)n n：由多聚甲醛粉末配制由多聚甲醛粉末配制2 2-4-4的固定液的固定液,较戊二醛固定液较戊二醛固定液的渗透力更强，并且能良好地保存样品中酶的活性。的渗透力更强，并且能良好地保存样品中酶的活性。常用于电镜细胞化学、免疫电镜和临床速检的前固定。常用于电镜细胞化学、免疫电镜和临床速检的前固定。固定时间在固定时间在3030分钟至几小时之内，固定温度以分钟至几小时之内，固定温度以44为佳。为佳。一、取材和固定一、取材和固定 多聚甲醛粉末配制多聚甲醛粉末配
29、制2 2-4-4的固定液配制方法：的固定液配制方法：储备储备A A液：液：多聚甲醛多聚甲醛20g20g，加入重蒸水，加入重蒸水5050mLmL，配制成，配制成4040多聚甲醛多聚甲醛水溶液。（注：在通风条件下配制，加热水溶液。（注：在通风条件下配制，加热6565，充分搅拌，充分搅拌后加几滴浓后加几滴浓NaOHNaOH使溶液透明）。使溶液透明）。储备储备B B液：液：0.2mol/L0.2mol/L缓冲液缓冲液(磷酸盐缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液)工作液：工作液：A A液液1010mLmL+B+B液液5050mLmL+重蒸水至重蒸水至100100mLmL(必要时可用葡萄
30、糖必要时可用葡萄糖或蔗糖调节渗透压或蔗糖调节渗透压)。一、取材和固定一、取材和固定4 4、四氧化锇、四氧化锇(O(Os sO O4 4)：特点特点:是对脂类的固定效果好，并能增加样品的反是对脂类的固定效果好，并能增加样品的反差，但其渗透速率较醛类要慢得多，常用于后固定，并且差，但其渗透速率较醛类要慢得多，常用于后固定，并且在固定之前必须把样品剁成小于在固定之前必须把样品剁成小于1 1mmmm3 3的碎块。的碎块。一、取材和固定一、取材和固定适合保存：适合保存：脂类和蛋白质脂类和蛋白质不适合保存：不适合保存：核酸，多糖核酸，多糖 四氧化锇四氧化锇是通过双键与不饱和的脂肪酸链形成脂肪是通过双键与不
31、饱和的脂肪酸链形成脂肪一饿复合物达到固定效果的，并能与蛋白质产生化学反应一饿复合物达到固定效果的，并能与蛋白质产生化学反应和交联的双重效应，因而能更好地稳固样品中含磷酸脂蛋和交联的双重效应，因而能更好地稳固样品中含磷酸脂蛋白的结构。但它对碳水化合物和核酸的固定效果不佳，所白的结构。但它对碳水化合物和核酸的固定效果不佳，所以常与戊二醛联合使用，作为后固定。以常与戊二醛联合使用，作为后固定。一、取材和固定一、取材和固定 四氧化锇是一种强氧化剂，配制和储存不当会产生锇四氧化锇是一种强氧化剂，配制和储存不当会产生锇黑黑(O Os sO O2 2)，使其失效，因此需冷冻、密封、避光保存，但，使其失效，因
32、此需冷冻、密封、避光保存，但在临用之前需彻底化开，以免浓度不准。在临用之前需彻底化开，以免浓度不准。四氧化锇对皮肤和粘膜有刺激作用，操作时要格外小四氧化锇对皮肤和粘膜有刺激作用，操作时要格外小心，最好使用通风橱，并戴防护手套心，最好使用通风橱，并戴防护手套。配制配制1 1的四氧化锇固定液的方法。（参见实验指导书）的四氧化锇固定液的方法。（参见实验指导书）一、取材和固定一、取材和固定（二）、脱水和浸透(一一)脱水的目的和原则脱水的目的和原则 绝大多数生物样品中水分的比例可达绝大多数生物样品中水分的比例可达7070一一8080以上，以上，而水中又有而水中又有8585一一9090为游离态水，再加上包
33、埋剂多为水为游离态水，再加上包埋剂多为水不溶性物质，如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水，不溶性物质，如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水，将直接影响包埋块的质量，并引起一系列不良后果，造成将直接影响包埋块的质量，并引起一系列不良后果，造成切片困难和成像模糊等。为了不破坏其超微空间结构，需切片困难和成像模糊等。为了不破坏其超微空间结构，需进行脱水进行脱水二、脱水和浸透二、脱水和浸透（2）梯度脱水目的逐步去除样品中的水，并防止样品收缩，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备。脱水过程（原则）：脱水过程（原则）：用系列梯度浓度的有机溶剂逐步替代样品中用系列梯度浓度的有机溶剂逐步替代样品中的游离水，以
34、达到既不破坏超微结构，又能彻底的游离水，以达到既不破坏超微结构，又能彻底除去样品中的游离态水的目的过程。除去样品中的游离态水的目的过程。二、脱水和浸透二、脱水和浸透 脱水剂的梯度幅度和每步脱水的时间都有讲究，梯度脱水剂的梯度幅度和每步脱水的时间都有讲究，梯度过大，脱水速度过快会使样品收缩，而脱水剂的浓度在过大，脱水速度过快会使样品收缩，而脱水剂的浓度在7070以前时，每步脱水的时间过长会使样品膨胀；在以前时，每步脱水的时间过长会使样品膨胀；在9595以以后每步脱水的时间过长会使样品收缩。后每步脱水的时间过长会使样品收缩。只有在只有在7070时，该环境与生物样品的渗透压相似，可时，该环境与生物样
35、品的渗透压相似，可停留较长时间，必要时可放在停留较长时间，必要时可放在44冰箱中过夜。冰箱中过夜。二、脱水和浸透二、脱水和浸透(二二)脱水剂的配制和脱水方法脱水剂的配制和脱水方法 脱水剂包括：脱水剂包括：甲醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、丙酮、环甲醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、丙酮、环氧丙烷等，氧丙烷等，最常用的脱水剂是最常用的脱水剂是乙醇和丙酮乙醇和丙酮。二、脱水和浸透二、脱水和浸透脱水方法：脱水方法：用乙醇脱水时，其浓度梯度为：用乙醇脱水时，其浓度梯度为：3030、5050、7070、8080、9090、9595、100100，每步，每步10-1510-15分分钟。钟。100100一步要重复一次
36、，一步要重复一次，7070以前需在以前需在44条条件下操作，从件下操作，从8080起可转至室温。起可转至室温。二、脱水和浸透二、脱水和浸透 我们知道，绝大多数生物样品中水分的比例我们知道，绝大多数生物样品中水分的比例很高，可达很高，可达70一一80以上，而水中又有以上，而水中又有85一一90为游离态水，再加上包埋剂多为水不为游离态水，再加上包埋剂多为水不溶性物质，因此如果包埋前不彻底除去样品中溶性物质，因此如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水，将直接影响包埋块的质量，并引的游离态水，将直接影响包埋块的质量，并引起一系列不良后果，如：起一系列不良后果，如：切片困难和成像模糊切片困难和成像模糊等等
37、。为了不破坏其超微空间结构，需进行脱水脱水过程：用系列梯度浓度的有机溶剂逐步替脱水过程：用系列梯度浓度的有机溶剂逐步替代样品中的游离水，以达到既不破坏超微结构，代样品中的游离水，以达到既不破坏超微结构，又能彻底除去样品中的游离态水的目的过程。又能彻底除去样品中的游离态水的目的过程。*可停在70%过夜，不能在其它浓度过夜*100%加干燥剂（如无水硫酸铜）保存在干燥器中以上为常规制样，脱水过程可根据样品不同进行调整，如植物样品可适当延长脱水时间。酒精浓度70%组织块膨胀组织块变化最小 组织块收缩脱水剂：既能与水相溶又能和包埋剂相溶。常用乙醇和丙酮。如果迅速脱水(如直接用100%)，会使样品水分抽取
38、，造成萎缩等变形。脱水顺序：酒精浓度50%70%80%90%100%100%时间10-15m10-15m10-15m10-15m45m45m温度4 4 4 4 或 室温室温室温脱水剂的配制方法如下：脱水剂的配制方法如下：用用 9 95 5的的乙乙醇醇配配制制系系列列浓浓度度梯梯度度脱脱水水剂剂 乙乙醇醇终终浓浓度度()取取 9 95 5乙乙醇醇m mL L 加加入入重重蒸蒸水水m mL L 3 30 0 6 60 0 1 13 30 0 5 50 0 1 10 00 0 9 90 0 7 70 0 1 14 40 0 5 50 0 8 80 0 1 16 60 0 3 30 0 9 90 0
39、1 18 80 0 1 10 0 二、脱水和浸透二、脱水和浸透 配制的脱水剂充分混合后，应放在配制的脱水剂充分混合后，应放在 44冰箱中冰箱中保存。由于乙醇与环氧树脂不能很好地混溶，可能保存。由于乙醇与环氧树脂不能很好地混溶，可能会影响包埋块的质量，如果选用环氧树脂包埋，用会影响包埋块的质量，如果选用环氧树脂包埋，用乙醇脱水后，最好再用环氧丙烷处理乙醇脱水后，最好再用环氧丙烷处理20-3020-30分钟，分钟，以置换出样品中的乙醇。以置换出样品中的乙醇。二、脱水和浸透二、脱水和浸透(三三)浸透的目的和方法浸透的目的和方法1 1、浸透的目的：、浸透的目的：用包埋剂逐步替代浸入样品内部的脱用包埋剂
40、逐步替代浸入样品内部的脱水剂，以填充样品超微结构的各个空间。水剂，以填充样品超微结构的各个空间。因为包埋剂的粘度要比脱水剂大得多，所以要用环氧因为包埋剂的粘度要比脱水剂大得多，所以要用环氧丙烷与包埋剂配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐丙烷与包埋剂配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐渐增加，以提高样品的质量。环氧丙烷能与环氧树脂类的渐增加，以提高样品的质量。环氧丙烷能与环氧树脂类的包埋剂能较好地混溶，有助于达到逐级浸透的目的。包埋剂能较好地混溶，有助于达到逐级浸透的目的。二、脱水和浸透二、脱水和浸透 浸透液的配制和使用方法：浸透液的配制和使用方法：1 1、环氧丙烷：包埋剂、环氧丙烷：包埋剂
41、3 3：1(V1(VV)30-60V)30-60分钟分钟2 2、环氧丙烷：包埋剂、环氧丙烷：包埋剂1 1：1(V1(VV)30-60V)30-60分钟分钟3 3、环氧丙烷：包埋剂、环氧丙烷：包埋剂1 1：3(V3(VV)30-60V)30-60分钟分钟4 4、100100包埋剂包埋剂 1-21-2小时小时 在室温或在室温或30-3530-35下浸透，必要时用慢速摇床相助能下浸透，必要时用慢速摇床相助能提高浸透的效果。浸透的时间可以灵活掌握。提高浸透的效果。浸透的时间可以灵活掌握。)二、脱水和浸透二、脱水和浸透（三）、包埋与聚合（三）、包埋与聚合（3）浸透与包埋目的使包埋剂浸透样品后，固化成硬块
42、（一）包埋（一）包埋 经过脱水和浸透的样品不能直接进行超薄切片，还需经过脱水和浸透的样品不能直接进行超薄切片，还需要用某种在一定条件下能聚合成硬块的单体树脂，来填充要用某种在一定条件下能聚合成硬块的单体树脂，来填充样品的各个空间，我们把这一过程称为包埋。样品的各个空间，我们把这一过程称为包埋。包埋的目的是一方面要支撑样品本身的超微结构，另包埋的目的是一方面要支撑样品本身的超微结构，另一方面能用于切片。我们把具有这种特性的单体树脂称为一方面能用于切片。我们把具有这种特性的单体树脂称为包埋剂。包埋剂。三、包埋与聚合三、包埋与聚合（二）包埋剂的选择（二）包埋剂的选择 理想的包埋剂应该具备以下特征：理
43、想的包埋剂应该具备以下特征：1 1、处于液态时粘度小、易渗透；固化后既不膨胀也不收处于液态时粘度小、易渗透；固化后既不膨胀也不收 缩，并有一定的机械强度助于保存样品的超微结构。缩，并有一定的机械强度助于保存样品的超微结构。2 2、在电子束的轰击下性能应该比较稳定，不易升华、变、在电子束的轰击下性能应该比较稳定，不易升华、变 形和断裂，并且质地均匀，不干扰样品本身的超微结形和断裂，并且质地均匀，不干扰样品本身的超微结 构并有良好的电子透过性。构并有良好的电子透过性。3 3、染色效果好和对人体毒害小。、染色效果好和对人体毒害小。三、包埋与聚合三、包埋与聚合包埋剂按其性质可以分为：包埋剂按其性质可以
44、分为：1 1、脂溶性包埋剂、脂溶性包埋剂2 2、水溶性包埋剂、水溶性包埋剂3 3、热聚合包埋剂、热聚合包埋剂4 4、低温聚合包埋剂等。、低温聚合包埋剂等。三、包埋与聚合三、包埋与聚合几种常用的包埋剂几种常用的包埋剂1 1、环氧树脂类包埋剂：、环氧树脂类包埋剂：多为脂溶性包埋剂，同时属于多为脂溶性包埋剂，同时属于一类热塑型树脂。一类热塑型树脂。优点：优点：热聚合时收缩小和在电子束的轰击下不易变形热聚合时收缩小和在电子束的轰击下不易变形 破裂等；破裂等；缺点：缺点：液态时对皮肤和粘膜有刺激作用，固化后包埋液态时对皮肤和粘膜有刺激作用，固化后包埋 块易受潮变软，使切片困难和结构模糊等。块易受潮变软，
45、使切片困难和结构模糊等。配制环氧树脂包埋剂时最好戴防护手套，并在通风条件配制环氧树脂包埋剂时最好戴防护手套，并在通风条件下操作；固化的包埋块要放入干燥器中保存。下操作；固化的包埋块要放入干燥器中保存。三、包埋与聚合三、包埋与聚合2 2、水溶性包埋剂：、水溶性包埋剂：先用它来代替乙醇先用它来代替乙醇(或丙酮或丙酮)作为脱作为脱水剂进行脱水，接着用它来包埋。水剂进行脱水，接着用它来包埋。水溶性包埋剂水溶性包埋剂可避免用乙醇可避免用乙醇(或丙酮或丙酮)脱水时所引起的脱水时所引起的对样品中某些成分的抽提，特别对脂类成分有较好的保存对样品中某些成分的抽提，特别对脂类成分有较好的保存作用。作用。这种包埋剂
46、对生物样品中的生化活性破坏小，所以常这种包埋剂对生物样品中的生化活性破坏小，所以常用于电镜细胞化学的研究。用于电镜细胞化学的研究。三、包埋与聚合三、包埋与聚合水溶性包埋剂的不足之处：水溶性包埋剂的不足之处：在切片和染色过程中，超薄切片易被水溶解而破碎。在切片和染色过程中，超薄切片易被水溶解而破碎。解决办法：解决办法：在包埋的最后一步，用环氧树脂来替代水溶性包埋在包埋的最后一步，用环氧树脂来替代水溶性包埋剂，再进行聚合。剂，再进行聚合。三、包埋与聚合三、包埋与聚合(三三)包埋剂的配制包埋剂的配制 单纯用某一种物质作包埋剂往往效果不理想，常用多单纯用某一种物质作包埋剂往往效果不理想，常用多种物质配
47、制成复合包埋剂。种物质配制成复合包埋剂。一些常用的参考配方有：一些常用的参考配方有：1 1、环氧树脂、环氧树脂EPON 812 EPON 812 2 2国产环氧树脂国产环氧树脂618618 3 3GMAGMA 4 4LKLK4 4M M三、包埋与聚合三、包埋与聚合浸透的目的是用包埋剂逐步替代浸入样品内部的脱水剂，以填充样品超微结构的各个空间。因为包埋剂的粘度要比脱水剂大得多，所以要用环氧丙烷与包埋剂配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐渐增加，以提高样品的质量。环氧丙烷能与环氧树脂类的包埋剂能较好地混溶，有助于达到逐级浸透的目的。包埋 经过脱水和浸透的样品不能直接进行超薄切片，还需要用某种在一
48、定条件下能聚合成硬块的单体树脂，来填充样品的各个空间，我们把这一过程称为包埋。包埋的目的是一方面要支撑样品本身的超微结构，另一方面使能切片。我们把具有这种特性的单体树脂称为包埋剂。包埋剂的选择 包埋时需要选择优质适用的包埋剂。理想的包埋剂应该具备以下特征：1、处于液态时粘度小、易渗透；固化后既不膨胀也不收缩，并有一定的机械强度，有助于保存样品的超微结构和制备超薄切片。2、优质的包埋剂制备的切片，在电子束的轰击下性能应该比较稳定，不易升华、变形和断裂，并且质地均匀，不干扰样品本身的超微结构并有良好的电子透过性。3、染色效果好和对人体毒害小。目前常用多种成分联合使用，以达到理想的结果。脱水剂+包埋
49、剂 1 ：1 包埋剂包埋剂包埋剂 1h过夜12-48h24-48h37或 室温 37 45 60 胶囊中胶囊中胶囊中*不要加盖不要加盖*室温室温下干燥器中可保存相当长时间下干燥器中可保存相当长时间(四四)包埋的操作方法包埋的操作方法 样品经过取材、固定、脱水、渗透以后，就可进行样品经过取材、固定、脱水、渗透以后，就可进行包埋。包埋。包埋具体的操作方法：包埋具体的操作方法：1 1选择包埋模具：选择包埋模具：目前最常用的各种类型的包目前最常用的各种类型的包埋模具有以下几种。（图）埋模具有以下几种。（图）三、包埋与聚合三、包埋与聚合三、包埋与聚合三、包埋与聚合 塑料和橡胶制的包埋模具可以反复使用若干
50、次。其中塑料和橡胶制的包埋模具可以反复使用若干次。其中扁盘型的模具适宜做定向包埋，包埋时将长条状样品平放扁盘型的模具适宜做定向包埋，包埋时将长条状样品平放其中，切片时可以选择一定的方向（正切或斜切等）。其中，切片时可以选择一定的方向（正切或斜切等）。圆柱型的塑料模具和橡胶模具在顶部已经呈圆锥型或圆柱型的塑料模具和橡胶模具在顶部已经呈圆锥型或立体梯型，便于修块。医用胶囊便宜，修块时稍烦琐。立体梯型，便于修块。医用胶囊便宜，修块时稍烦琐。包埋时所用模具一定要洁净干燥，必要时在使用之前包埋时所用模具一定要洁净干燥，必要时在使用之前放入放入3737烤箱中预干燥烤箱中预干燥1-21-2小时。小时。三、包
