1、无菌检查法培训无菌检查法培训 一、检测标准中华人民共和国药典2019年版 附录 无菌检查法（2019年7月1日起执行）二、检测环境|无菌检查应在环境洁净度 10 000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。|洁净度标准：医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。|无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于3035培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。三、名词解释1、好氧微生物：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。2、厌氧微生物：在
2、代谢中，没有氧条件下才能生存的微生物。3、兼性微生物：能够在有氧和无氧条件下代谢的微生物。4、培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生长培养基和培养方式的组合。5、假阴性：实际阳性的无菌实验结果被变成了阴性。6、假阳性：实际阴性的无菌实验结果被变成了阳性。7、促生长实验：用于证明生长培养基能够支持微生物生长的技术条件。四、样品量|检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。|检验量：指一次试验所用的供试品总量。|除另有规定外，出厂产品按表 1规定；上市产品监督检验按表2、表 3规定。表1、表 2、表 3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。（一般情况下，供试品无菌检查若采用
3、薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品 1支（或瓶）作阳性对照用。）|表 1 批出厂产品最少检验数量|表 2.液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量|表3.固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数五、实验材料的准备1、培养基及稀释液（1)硫乙醇酸盐流体培养基（2）改良马丁培养基（3）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液2、培养基的制备及培养条件|直接购买配制好的干粉培养基，按培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及蒸馏水进行配制之后，按说明上的温度、时间要求进行培养基灭菌。注：对硫乙醇酸盐流体培养基，配好后，须煮沸，再灭菌。培养基氧化层的高
4、度不得超过培养基深度的1/5。|硫乙醇酸盐流体培养基，置3035培养。|改良马丁培养基，置2328培养。3、其他实验材料|剪刀、镊子|滤器、微孔滤膜|量筒|培养器|以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160 2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121蒸汽灭菌30分钟后使用。4、培养基的适用性检查|无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。|无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。|灵敏度检
5、查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。|金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003|铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10 104|枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501|生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64 941|白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98 001|黑曲霉(
6、Aspergillus niger)CMCC(F)98 003|菌液制备|接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 18小时24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2328培养 2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。|接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养 57天，加入35ml含 0.05（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗
7、脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。|菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保存在28可在 24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。|培养基接种 取每管装量为 12ml的硫乙醇酸盐流体培养基 9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各 2支，另 1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于 100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空
8、白对照，培养5天。逐日观察结果。|结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。六、实验设备|过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）|电子天平|压力蒸汽灭菌器|电热鼓风干燥箱|恒温培养箱|集菌仪5、供试品的准备 操作前，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。七、供试液的制备（薄膜过滤法）l用？ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液浸提供试品，混匀、立即过滤。l？：使供试品完全浸泡所需的 pH7.0氯
9、化钠-蛋白胨缓冲液的用量八、检查法薄膜过滤法|将供试液混匀，过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。优先采用封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或直接采用无菌集菌器。|如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培养基，另两只分别加入120ml硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤（
10、每只约50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基120ml，另一只加改良马丁培养基120ml分别作阴性对照。|如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对照。八、检查法直接接种法 每个供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，或培养基的装量足以浸没供试品。同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml及改良马丁培养基每管装量不少于10ml。九、对照实验|阳性对照应根据供试品特性选择对照菌
11、：无抑菌无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于 100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养 4872小时应生长良好。|阳性对照：一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照用；若采用直接直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作为阳性对照用。|阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，
12、作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。十、培养及观察|上述含培养基的容器按规定的温度培养 14天。硫乙醇酸盐流体培养基，置3035培养。改良马丁培养基，置2328培养。|培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养 14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养 2天、真菌培养 3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。十一、结果报告|阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。|若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定
13、；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。|试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。|十二、假阴性、假阳性结果|最小化假阳性的预防措施1、实验在一个有环境控制、有气流控制的专门的房间
14、中进行；2、在整个实验中使用无菌技术；3、进入实验区域的实验器具、培养基应避免污染。样品的外包装在进入实验区域前应消毒；4、实验台表面消毒；5、最小化操作手续；6、控制和评估培养箱的环境；7、最小化浮尘；8、灭菌所有的设备、材料和用品。|影响假阴性发生的因素1、培养条件不能支持微生物的生长（促生长试验）；2、在无菌实验中，产品中释放出了杀菌或微生物电解的物质（消除抑制物质）3、从灭菌处理到培养有一定的时间间隔（确定灭菌后产品的储存条件及储存时间）十三、实验过程中所用的记录1、培养基配制记录2、无菌检验原始记录3、灭菌设备、培养设备使用记录4、菌种使用记录5、培养基、阳性菌销毁记录6、培养基灵敏
15、度检查记录7、无菌检验室消毒记录8、检定菌接收、传代登记表9、冰箱温度检查记录10、无菌检验室温湿度记录11、无菌检验室臭氧消毒记录12、无菌检验室紫外灯使用记录13、无菌工作服清洗消毒记录14、消毒剂配制记录十四、实验全过程中的注意事项1、取样|质检人员要清楚样品的来源，确保样品具有代表性；|样品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。2、实验材料的准备|注意干粉培养基包装瓶上所写的灭菌温度和时间；|硫乙醇酸盐流体培养基必须在煮沸后，再进行分装、灭菌；|无菌实验的培养基最好现做现用。3、将样品及灭菌后的物品送入实验室|进入无菌检验室的样品若有两层包装的，需将外包装在传递窗或缓冲间拆除后，传入实验室。|进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。例如：紫外灯照射不少于30min。4、实验操作阶段|对不同种类和不同批次的产品，在拆包装及夹取样品时，应更换实验用具；|用集菌仪进行薄膜过滤时，注意培养器的针头部分不要污染。5、废弃物的处理|出具实验结果后，所有培养物须经121高压蒸汽灭菌30min的处理。
