1、阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验 Enterobacter sakazakii(ES)Enterobacter sakazakii(ES)3内容内容第一部分：一般特征第一部分：一般特征第二部分：致病性第二部分：致病性第三部分：第三部分：ESES的检验的检验4第一部分：一般特征第一部分：一般特征一一培养特征培养特征二二生化反应生化反应三三抵抗力抵抗力四四增殖能力增殖能力与其他常见肠杆菌相似与其他常见肠杆菌相似5一、培养特征一、培养特征 ESES在在VRBGAVRBGA平板上首次划线分离时，平板上首次划线分离时，3737培养培养24h24h可生成可生成2 2种不同的形态学特征：种不同的形态学特征：1.
2、1.干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复。传代属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。培养后可能会转变为典型的光滑菌落。2.2.光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。_国外文献报道国外文献报道6本实验室本实验室1.1.大多数分离株呈流蜡样，大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、圆形、光滑、凸粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满，并散发出特殊起、饱满，并散发出特殊气味；气味；2.2.干燥、顶
3、端发白的粉紫色干燥、顶端发白的粉紫色菌落；菌落；3.3.从配方粉中初次分离到的从配方粉中初次分离到的该菌在该菌在VRBGAVRBGA平板上过夜平板上过夜培养后呈现特殊的菌落形培养后呈现特殊的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶态：菌落干燥、边缘有褶皱，极富弹性。传代后，皱，极富弹性。传代后，菌落皱褶减少，延长培养菌落皱褶减少，延长培养时间，可见皱褶逐渐增加。时间，可见皱褶逐渐增加。7二、生化反应二、生化反应 特征性生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+-葡萄糖苷酶+8ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌
4、日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶KCN生长v发酵:蔗糖()卫矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黄色素()注：90-100；()：75-89%；V ：25-74；()：10-24；：0-99三、抵抗力三、抵抗力 耐热性耐热性 渗透压渗透压 干燥干燥 不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消巴氏消毒毒过程能有效的灭活过程能有效的灭活ESES。ES ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增加增加PIFPIF加工后污染的危险性，使其在加
5、工后污染的危险性，使其在PIFPIF中长期存活。中长期存活。10四、增殖能力四、增殖能力 66，2121，3737分别是分别是13.7h13.7h，1.7h1.7h，191921min21min。MRAMRA发现，与本底相比，发现，与本底相比，2525放置放置6h6h该菌的相对危该菌的相对危险性可增加险性可增加3030倍；倍；2525放置放置10h10h可增加可增加30 00030 000倍。倍。20042004年年2 2月月FAO/WHOFAO/WHO在日内瓦召开的在日内瓦召开的PIFPIF中中ESES专家研专家研讨会上提出讨会上提出PIFPIF中微量的中微量的ESES（）污染）污染也能导致
6、感染的发生。也能导致感染的发生。11第二部分：致病性第二部分：致病性一一易感人群易感人群二二主要感染渠道主要感染渠道三三配方粉中配方粉中ESES的污染状况的污染状况四四PIFPIF中中ESES的来源及中毒发生的原因的来源及中毒发生的原因12一、易感人群一、易感人群婴儿：婴儿：1.1.脑膜炎脑膜炎2.2.坏死性小肠结肠炎坏死性小肠结肠炎3.3.菌血症菌血症严重的神经系统后遗症严重的神经系统后遗症高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出生体重等生体重等免疫力低下免疫力低下的婴儿。的婴儿。死亡率：死亡率：50%50%，20-50%20-50%成
7、人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等13二、主要感染渠道二、主要感染渠道 ！乳品安全标准（报批稿）乳品安全标准（报批稿）婴儿配方食品婴儿配方食品特殊医学用途配方食品特殊医学用途配方食品0-6个月龄个月龄14三、配方粉中三、配方粉中ESES的污染状况的污染状况研究研究样品样品肠杆菌（肠杆菌（+）ES（+）菌种（菌种（%）Muytjens 等1980141（MPN/100g）75（51.8%）20（14.2%）E.agglomerans(24.8)E.cloacae(21.3)E.sakazakii(14.2)Iversen和Forsythe 200482（25g
8、）7（8.5%）2（2.4%）Pantoea spp（2.4)E.cloacae(1.2)E.sakazakii(2.4)本试验室2006212（40g）103（48.58%）11（5.19%）Pantoea spp（11.32）E.cloacae（7.55）E.sakazakii（5.19）食品、环境广泛分布15四、四、PIFPIF中中ESES的来源及中毒发生的原因的来源及中毒发生的原因 目前公共卫生关注的目前公共卫生关注的PIFPIF中中ESES的来源包括以的来源包括以下下2 2种情况：种情况：内在污染内在污染 二次污染。二次污染。如：加工环境中微生物的存在；加工装置如：加工环境中微生物的
9、存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理后，与干燥基粉内表面微生物的存在；热处理后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物。混合的加入成分中存在的微生物。外源性污染外源性污染配方粉调制环境和调制器皿。配方粉调制环境和调制器皿。受受ESES污染的配方粉或调制配方在较高温度污染的配方粉或调制配方在较高温度下存放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食下存放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致时间较长等都可导致ESES有机会生长繁殖，增加有机会生长繁殖，增加患病的危险性。患病的危险性。16 PIF PIF中中ESES的安全性问题，已成为全球关注的焦点。的安全性问题，已成为全球关注的焦点。2
10、0022002年年ICMSFICMSF把把ESES列为列为“严重危害特殊人群，威胁严重危害特殊人群，威胁生命、导致慢性实质性后遗症或长期影响生命、导致慢性实质性后遗症或长期影响”的一的一种病原菌。种病原菌。20042004年年2 2月月FAO/WHOFAO/WHO在日内瓦召开的在日内瓦召开的PIFPIF中中ESES专家研专家研讨会：讨会：ESES列为列为PIFPIF中仅有的两种中仅有的两种A A类致病菌（沙门类致病菌（沙门和阪崎）之一。和阪崎）之一。17第三部分第三部分食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验本标准修改采用本标准修改采用1.ISO/TS 22964（
11、1st edition 2006-02-01）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii2.FDA July 2002;Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 19第一法：阪崎肠杆菌的检验第一法：阪崎肠杆菌的检验第二法：阪崎肠杆菌的计数第二法：阪崎肠杆菌的计数20第一法第一法 阪崎肠杆菌的检验阪崎肠杆菌的检验21阪崎肠杆菌检验程序阪崎肠杆菌
12、检验程序 报 告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g/mL+稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选择性增菌选择性分离生 化 鉴 定TSA251，48 h4h5.1 5.1 前增菌和增菌前增菌和增菌BPWBPW（合适时可选择无菌水合适时可选择无菌水）左图：未混合；左图：未混合；右图：混合后。右图：混合后。23mLST-VmmLST-Vm mLST-Vm mLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤，即在大肠菌群增菌肉汤LSTLST中另加入中另加入适量的适量的NaClNaCl和和Vm Vm。研究证明
13、与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏菌等）相比，氏菌等）相比，ESES具有较高的耐渗透压能力。加入具有较高的耐渗透压能力。加入0.5 M 0.5 M 的的NaClNaCl在保证在保证ESES良好生长的同时，可以有效地抑制上述良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。其他细菌的生长。VmVm可有效地抑制可有效地抑制G+G+菌的生长。而较高的生长温度可以进菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。一步抑制其他细菌的生长。245.2 5.2 分离分离 显色培养基的基本原理相似，二者都显色培养基的基本原理相似，二者都是根据是根
14、据ESES能产生能产生-葡萄糖苷酶，分解底物葡萄糖苷酶，分解底物XaGlcXaGlc产生有色菌落。产生有色菌落。25显色培养基对显色培养基对ESES的选择性较好，的选择性较好，ESES形成的特征性菌形成的特征性菌落易于辨认，以落易于辨认，以DFIDFI为例：为例：1.1.硫化氢指示剂可以区分硫化氢指示剂可以区分ESES和产生少量和产生少量-葡萄糖苷酶但葡萄糖苷酶但H2SH2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。阳性菌株（如普通变形杆菌）。2.2.ESES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落3.3.其他常见菌在其他常见菌在DFIDFI平板的菌落颜色平板的菌落颜色a.a
15、.白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等氏菌、泛菌属的多种菌等b.b.黄色菌落：赫氏埃希氏菌黄色菌落：赫氏埃希氏菌c.c.黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:ESIA:蓝蓝色，色，1-3mm1-3mm国产显色培养基国产显色培养基2636361124 h24 h2h2h27黄色素黄色素TSATSA：2525培养后培养后典型典型ESES：黄色：黄色阴性对照阴性对照E.coli E.coli ATCC 25922ATCC 25922：白色菌落：白色菌落285.3 鉴定（生化反应）
16、鉴定（生化反应）生化试验特征黄色素产生氧化酶L-赖氨酸脱羧酶L-鸟氨酸脱羧酶（）L-精氨酸双水解酶柠檬酸水解()发酵：D-山梨醇（）L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙注：99%阳性；99%阴性；（）90%99%阳性；（）90%-99%阴性。29商业生化鉴定系统的应用商业生化鉴定系统的应用 推荐使用的推荐使用的ESES生化鉴定方法有很多，主要有生化鉴定方法有很多，主要有API 20EAPI 20E，ID 32EID 32E，Biolog GN2 MicroPlateBiolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+VITEK GNI+等。等。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许
17、多国上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。家和组织的标准采用。在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API API 20E20E和和Vitek GNI+Vitek GNI+。30API 20E生化鉴定板典型生化反应图示 API 20E反应编码API 20E结果评价3345 373Excellent identification3305 173Excellent identification3305 363Very good identification3305 373Good identificationAcceptable identif
18、ication？31质量控制质量控制 选择近期分离的阪崎肠杆菌选择近期分离的阪崎肠杆菌阳性菌株或阳性菌株或标准菌株标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质量控制。量控制。32阪崎肠杆菌检测方法的比较2005年从10个省（市）的零售或批发市场采集的194份配方粉。FDA定性检测检出4个阳性样本，本定性检测检出5个，其中4个在第一法的检测中均为阳性，另一阳性检出样品在第一法中的检测结果为阴性。*“粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满”。选
19、择性分离平板上分离株的菌落特征和样品数量 VRBGA DFI菌落特征样品数量菌落特征样品数量无任何菌落生长14无任何菌落生长163直径1mm的菌落1371种蓝绿色菌落52种菌落61种白色菌落22典型菌落*5（3）白色菌落和蓝绿色菌落各1种31种非典型菌落32（1）1种白色菌落但略显淡绿1合计194合计19433第二法第二法 阪崎肠杆菌的计数阪崎肠杆菌的计数343 3管管MPNMPN法法35不要在你的智慧中夹杂着傲慢。不要使你的谦虚心缺乏智慧。每天都将自己最好的一面展示给别人。杨丽娜愚痴的人，一直想要别人了解他。有智慧的人，却努力的了解自己。瀑布跨过险峻陡壁时，才显得格外雄伟壮观。不如意的时候不要尽往悲伤里钻，想想有笑声的日子吧！眼中闪烁的泪光，也将化作永不妥协的坚强。不如意的时候不要尽往悲伤里钻，想想有笑声的日子吧！多讲点笑话，以幽默的态度处事，这样子日子会好过一点。目标不是都能达到的，但它可以作为瞄准点。人生志气立，所贵功业昌。只有一条路不能选择那就是放弃。世界上没有比友谊更美好更令人愉快的东西了；没有友谊，世界仿佛失去了太阳。
