1、高通量测序技术临床应用的关键问题高通量测序技术临床应用的关键问题精准医学不等于高通量测序精准医学不等于高通量测序 高通量测序是精准医学目前最为重要的支撑技术！高通量测序是精准医学目前最为重要的支撑技术！我国已开展的与测序密切相关我国已开展的与测序密切相关“精准医学精准医学”研究研究 大规模人群队列研究大规模人群队列研究百万级自然人群国家大型健康队列研究百万级自然人群国家大型健康队列研究 重大疾病专病队列研究重大疾病专病队列研究中国人群参比数据库中国人群参比数据库建设与系统分析建设与系统分析 2016年年 2017年年 2016年年 2017年年 2017年年大型自然人群队列示范华东区域心血管疾
2、病免疫系统疾病中国人群多组学参比数据与分析系统建设京津冀区域华南区域脑血管疾病神经系统疾病华中区域西北区域呼吸系统疾病精神心理疾病西南区域代谢性疾病肺癌东北区域乳腺癌前列腺癌食管癌肝癌/肝病罕见病结直肠癌胃癌高通量测序技术的临床应用高通量测序技术的临床应用 染色体非整倍体无创产前筛查染色体非整倍体无创产前筛查（NIPS）胚胎植入前遗传学筛查胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening，PGS）和胚胎植入前基因诊断胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）肿瘤靶向治疗基因突变检测肿瘤靶向治疗基因突变检
3、测 单基因遗传病检测 病原微生物检测病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序 以肺癌基因突变检测与临床用药为例NCCN指南的变化与指南的变化与NGS2011 Version转移和复发的治疗转移和复发的治疗一线治疗一线治疗确定确定组织学组织学亚型亚型l 腺癌腺癌l 大细胞癌大细胞癌l NSCLC NOSEGFR突变突变检测检测（I类）类）EGFR突变突变阴性或未知阴性或未知EGFR突变突变阳性阳性一线治疗前一线治疗前发现发现EGFR突变突变化疗期间化疗期间发现发现EGFR突变突变厄洛替尼厄洛替尼或或吉非替尼吉非替尼原化疗联合原化疗联合:厄洛替尼或厄洛替尼或吉非替
4、尼吉非替尼或或换药维持治疗换药维持治疗:厄洛替尼或厄洛替尼或吉非替尼吉非替尼肿瘤肿瘤进展进展肿瘤肿瘤进展进展l 鳞状细胞癌鳞状细胞癌EGFR突变突变检测检测EGFR突变突变阴性或未知阴性或未知双药联合化疗或双药联合化疗或抗血管生成药物抗血管生成药物+化疗或化疗或EGFR单克隆抗体单克隆抗体+化疗化疗推荐顺铂联合培美曲塞（推荐顺铂联合培美曲塞（I类）类）双药联合化疗或双药联合化疗或EGFR单克隆抗体单克隆抗体+化疗化疗二线或二线或三线治疗三线治疗二线或二线或三线治疗三线治疗2012 Version转移和复发的治疗转移和复发的治疗一线治疗一线治疗确定组织学亚型l 腺癌l 大细胞癌l NSCLC N
5、OSlEGFR突变检突变检测（测（1类）类）lALK检测（新增）检测（新增）EGFR突变或突变或ALK阴性或未知阴性或未知EGFR突变阳性突变阳性一线治疗前一线治疗前发现发现EGFR突变突变化疗期间化疗期间发现发现EGFR突变突变厄洛替尼厄洛替尼 (1类类)换药维持治疗换药维持治疗:厄洛替尼或厄洛替尼或厄洛替尼联合化疗厄洛替尼联合化疗（2B类）类）l 鳞状细胞癌EGFR突变和突变和ALK检测均不检测均不作为常规推荐作为常规推荐双药联合化疗或抗血管生成药物+化疗或EGFR单克隆抗体+化疗双药联合化疗或西妥昔单抗/长春瑞滨/顺铂肿瘤进展二线或三线治疗肿瘤进展二线或三线治疗EML4-ALK融合阳性融
6、合阳性克唑替尼克唑替尼肿瘤进展二线或三线治疗2013 Version转移灶的系统治疗组织学亚型有足够的样本来有足够的样本来确确定组织学亚型定组织学亚型戒烟咨询戒烟咨询l 腺癌腺癌l 大细胞癌大细胞癌l NSCLC NOSlEGFR突突 变检测变检测 （1类）类）lALK检测检测cc EGFR突变突变和和ALK阴性阴性EGFR突变突变阳性阳性一线治疗前一线治疗前发现发现EGFR突变突变化疗期间化疗期间发现发现EGFR突变突变厄洛替尼厄洛替尼 (1类类)换药维持治疗换药维持治疗:厄洛替尼或厄洛替尼或厄洛替尼联合化疗厄洛替尼联合化疗l 鳞状细胞癌鳞状细胞癌EGFR突变和突变和ALK检测均不检测均不作
7、为常规推荐作为常规推荐除非是从不吸除非是从不吸烟患者或小活检样本烟患者或小活检样本双药联合化疗双药联合化疗或抗血管生成或抗血管生成药物药物+化疗化疗或或EGFR单克隆单克隆抗体抗体+化疗化疗双药联合化疗（双药联合化疗（1类类）或）或西妥昔单抗西妥昔单抗/长春瑞滨长春瑞滨/顺铂顺铂（2B类）类）ALK阳性阳性克唑替尼克唑替尼肿瘤肿瘤进展进展qq,rr二线或二线或三线三线治疗治疗转移灶一线治疗2014 Version转移灶的系统治疗转移灶的系统治疗组织学亚型组织学亚型有足够的样本来确定有足够的样本来确定组织学亚型（组织学亚型（如有需如有需要可考虑重复取材要可考虑重复取材）戒烟咨询戒烟咨询集成姑息治
8、疗集成姑息治疗l 腺癌腺癌l 大细胞癌大细胞癌l NSCLC NOSlEGFR突突 变检测变检测 （1类）类）lALK检测检测 （1类）类）lEGFRALK应应该作为多基因检该作为多基因检测测/二代测序的一二代测序的一部分部分cc EGFR突变突变和和ALK阴性阴性或未知或未知EGFR突变突变阳性阳性一线治疗前一线治疗前发现发现EGFR突变突变化疗期间化疗期间发现发现EGFR突变突变厄洛替尼厄洛替尼(1类类)或或阿法替尼（阿法替尼（1类）类）中断或完成现有化疗后开中断或完成现有化疗后开始厄洛替尼或阿法替尼治始厄洛替尼或阿法替尼治疗或现有化疗联合厄洛替疗或现有化疗联合厄洛替尼或阿法替尼尼或阿法替
9、尼 （2B类）类）l 鳞状细胞癌鳞状细胞癌l考虑考虑EGFR突变和突变和ALK检测特别检测特别是从不吸烟患者或小活检或混合是从不吸烟患者或小活检或混合样本样本lEGFRALK应该作为多基因检应该作为多基因检测测/二代测序的一部分二代测序的一部分cc双药联合化疗（双药联合化疗（1类类）或抗血管生成或抗血管生成药物药物+化疗化疗或或EGFR单克隆单克隆抗体抗体+化疗（化疗（2B类类）双药联合化疗（双药联合化疗（1类）或类）或西妥昔单抗西妥昔单抗/长春瑞滨长春瑞滨/顺铂顺铂（2B类）类）ALK阳性阳性转转移移灶灶一线治疗一线治疗一线治疗前一线治疗前发现发现ALK重排重排化疗期间化疗期间发现发现ALK
10、重排重排克唑替尼克唑替尼中断或完成现有化疗后开中断或完成现有化疗后开始克唑替尼治疗始克唑替尼治疗NCI-MATCH Trial(Molecular Analysis for Therapy Choice)The Trial：NCI-MATCH,also known as MATCH,is a precision medicine cancer treatment clinical trial.In this trial,patients are assigned to receive treatment based on the genetic changes found in their t
11、umors through genomic sequencing and other tests.Genomic sequencing is a laboratory method that is used to determine the genetic makeup of cancer cells.There are 18 treatment arms that are currently open to patients,each enrolling patients whose tumors have a specific genetic change.Most treatment a
12、rms will enroll 35 patients.However,a few treatment arms address more common genetic changes,and for those up to 70 patients per arm will be enrolled.Types of Cancers Studied：A goal for the study is for about 25%of patients to have rare or uncommon cancers.So far,the trial has exceeded this goal,wit
13、h about 60%of the enrolled patients having cancers other than colon,rectal,breast,non-small cell lung,or prostate.https:/www.cancer.gov/about-cancer/treatment/clinical-trials/nci-supported/nci-matchArmTargeted Genetic ChangeDrug(s)AEGFR mutAfatinibC1MET ampCrizotinibC2MET ex 14 skCrizotinibEEGFR T79
14、0MAZD9291FALK translocCrizotinibGROS1 translocCrizotinibHBRAF V600Dabrafenib+trametinibLmTOR mutTAK-228(formerly MLN0128)MTSC1 or TSC2 mutTAK-228(formerly MLN0128)RBRAF nonV600 or BRAF fusionTrametinibS2GNAQ/GNA11 mutTrametinibTSMO/PTCH1 mutVismodegibUNF2 lossDefactinibVcKIT mutSunitinibXDDR2 mutDas
15、atinibZ1BCCND1,2,3 ampPalbociclibZ1CCDK4 or CDK6 ampPalbociclibZ1ENTRK fusionsLarotrectinib(LOXO-101)Treatment Arms that Are Open and Enrolling Patients How Patients Are Identified for NCI-MATCH：Participating labs include:Foundation Medicine,Inc.，Caris Life Sciences，MD Anderson Cancer Center，Memoria
16、l Sloan-Kettering Cancer Center.Foundation Medicine,Inc.and Caris Life Sciences will identify potential MATCH participants from the large numbers of cancer patients whose tumors they currently test from about 1,100 hospitals and clinics that are taking part in the MATCH trial.MD Anderson and Memoria
17、l Sloan-Kettering will identify potential participants only from among their own patients.Goals of NCI-MATCHu The primary goal for MATCH is to determine the percentage of patients whose tumors have a complete or partial response（CR or PR）to treatment,meaning the tumors shrink by a certain amount.Thi
18、s is called the objective response rate(ORR).Treatments will be considered promising if at least 16%of the patients in an arm have tumor shrinkage.u A secondary goal for the trial is to determine the percentage of patients whose disease does not worsen for at least six months.This is known as progre
19、ssion-free survival.（PFS）u In addition to assessing the objective response rate and progression-free survival,researchers will also determine time to progression(TTP)of the cancer and evaluate the side effects of the treatments.NCI-MATCH Trial(Molecular Analysis for Therapy Choice)https:/www.cancer.
20、gov/about-cancer/treatment/clinical-trials/nci-supported/nci-matchNGS assay for NCI-MATCH Trial The Oncomine Cancer Panel assay and the Personal Genome Machine(PGM)were used in NCI-MATCH Trial.,and more than 4000 mutations covering 143 genes were detected.performance verification results by MD Ander
21、son Cancer CenterJ Mol Diagn.2017;19(2):313-327.SensitivitySpecificityLODSNVs99.02%99.99%2.80%Indels95.00%99.98%10.50%Large indels(gap 4 bp)97.50%100%6.80%CNVs92.50%100%4 copiesGene fusions97.67%99.99%N/ACombined overall96.98%99.99%N/Abasket trial and umbrella trialBasket trials（篮子试验篮子试验）are designe
22、d to test the effect of a single drug on a single mutation in a variety of cancer types.（treating the different cancer with same drugs 异癌同治异癌同治）Umbrella trials（伞试验伞试验）are designed to test the impact of different drugs on different mutations in a single cancer type.（treating the same cancer with diff
23、erent drugs 同癌异治同癌异治）2014 Version2014版NCCN指南中多基因联合/二代测序检测内容：要求考虑除EGFR突变和ALK重排之外的其他基因检测Targeted Agents for Patients with Other Genetic Alterations 2015 Version转移灶的系统治疗转移灶的系统治疗组织学亚型组织学亚型有足够的样本来确定组织学亚型（如有需要可考虑重复取材）戒烟咨询集成姑息治疗l 腺癌l 大细胞癌l NSCLC NOSlEGFR突 变检测 （1类）lALK检测 （1类）lEGFRALK应该作为多基因检测/二代测序的一部分cc EGF
24、R突变突变和和ALK均为均为阴性或未知阴性或未知EGFR突变突变阳性阳性一线治疗前一线治疗前发现发现EGFR突变突变化疗期间化疗期间发现发现EGFR突变突变厄洛替尼厄洛替尼(1类类)或阿法替尼（或阿法替尼（1类）类）中断或完成现有化疗后开中断或完成现有化疗后开始厄洛替尼或阿法替尼治始厄洛替尼或阿法替尼治疗或现有化疗联合厄洛替疗或现有化疗联合厄洛替尼或阿法替尼尼或阿法替尼 （2B类）类）l 鳞状细胞癌l考虑EGFR突变和ALK检测特别是从不吸烟患者或小活检或混合样本lEGFRALK应该作为多基因检测/二代测序的一部分cc双药联合化疗（双药联合化疗（1 1类）类）或抗血管生成或抗血管生成药物药物+
25、化疗化疗ALK阳性阳性转移灶一线治疗一线治疗一线治疗前一线治疗前发现发现ALK重排重排化疗期间化疗期间发现发现ALK重排重排克唑替尼克唑替尼(1类类)中断或完成现有化疗后开始中断或完成现有化疗后开始克唑替尼治疗克唑替尼治疗检测结果检测结果EGFR突变突变阳性阳性ALK阳性阳性EGFR突变突变和和ALK均为均为阴性或未知阴性或未知腺癌、大细胞癌、腺癌、大细胞癌、NSCLC NOS腺癌、大细胞癌、腺癌、大细胞癌、NSCLC NOS双药联合化疗（双药联合化疗（1类）类）支持治疗支持治疗2015 VersionEmerging Targeted Agents for Patients with Oth
26、er Genetic Alterations 2016Version 2016 Version2016Version 2016年起，新增年起，新增Osimertinib（AZD9291）用于治疗携带）用于治疗携带EGFR T790M突变患者突变患者 2016Version 2016年开始，年开始，NCCN指南对于指南对于ALK融合阳性的患者治疗中新增罗氏融合阳性的患者治疗中新增罗氏Alectinib（艾乐替尼、阿雷替尼）（艾乐替尼、阿雷替尼）2017 Version2017 Version2018 Version日本日本ARIAD的的Brigatinib（AP26113）（布吉他滨）（布吉他滨
27、）和诺华的和诺华的Ceritinib（色瑞替尼）（色瑞替尼）ROCHE旗下的基因泰克（旗下的基因泰克（Genentech.Inc）的）的atezolizumab（阿特朱单抗，针对（阿特朱单抗，针对PD-L1）分子检测的伴随诊断（分子检测的伴随诊断（companion diagnostics）概念）概念 A companion diagnostic is a medical device,often an in vitro device,which provides information that is essential for the safe and effective use of a
28、 corresponding drug or biological product.The test helps a health care professional determine whether a particular therapeutic products benefits to patients will outweigh any potential serious side effects or risks.Companion diagnostics can:uidentify patients who are most likely to benefit from a pa
29、rticular therapeutic product;uidentify patients likely to be at increased risk for serious side effects as a result of treatment with a particular therapeutic product;orumonitor response to treatment with a particular therapeutic product for the purpose of adjusting treatment to achieve improved saf
30、ety or effectiveness.uIf the diagnostic test is inaccurate,then the treatment decision based on that test may not be optimal.https:/www.fda.gov/MedicalDevices/./InVitroDiagnostics/ucm407297.htm日新月异日新月异 2016年年12月月19日日，FDA批准FoundationFocusTM CDx BRCA为第一个基于二代第一个基于二代测序的伴随诊断试剂盒测序的伴随诊断试剂盒，用于鉴定携带BRCA突变的晚期卵
31、巢癌患者突变的晚期卵巢癌患者，并指导Clovis Oncology公司生产的聚聚ADP-核糖聚合酶核糖聚合酶(PARP)抑制剂抑制剂Rubraca(rucaparib)的用药，后者适用于已经用两种或更多种化疗治疗并且携带有害的BRCA1和和BRCA2基因突变基因突变（胚系遗传或体细胞突变获得的胚系遗传或体细胞突变获得的）的晚期卵巢癌患者。在Foundation Medicine,Inc实验室中应用，用于FFPE样本检测。2017年年5月月23日日，美国FDA批准默沙东的Keytruda（PD-1/PD-L1单抗单抗）用于治疗成人及儿童的不可切除的或转移性的、微卫星高度不稳定微卫星高度不稳定（m
32、icrosatelliteinstability-high，MSI-H）的或错配修复缺陷错配修复缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）的实体瘤患者（15肿瘤肿瘤）。日新月异日新月异 2017年年5月月27日日，美国FDA批准扩大诺华诺华Zykadia（ceritinib赛立替尼赛立替尼）用于ALK+转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗。2017年年6月月22日日，FDA批准了基于Thermo Fisher的ion torrent ampliseq技术，采用PGM DX系统，赛默飞世尔科技公司Oncomine DX Target Test（可同时检测23个基因）
33、中的BRAF、ROS1和EGFR突变二代基因测序检测，作为非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中阿斯利康阿斯利康的EGFR抑制剂易瑞沙（吉非替尼）易瑞沙（吉非替尼）、辉瑞辉瑞的ALK和ROS1抑制剂Xalkori（crizotinib），以及诺华公司诺华公司MEK抑制剂Mekinist曲美替曲美替尼尼（trametinib）和抑制剂Tafinlar（dabrafenib）这4种药物的伴随诊断试剂盒，在美国3个CLIA实验室中应用。这是FDA批准的第一个可筛查多个标志物的肿瘤批准的第一个可筛查多个标志物的肿瘤二代基因测序检测二代基因测序检测。用于FFPE样本检测。2017年年6月月29日日，美，美FD
34、A批准批准Illumina与与Amgen公司合作开发的公司合作开发的Extended RAS Panel（检测（检测KRAS基因基因和和NRAS基因基因56个变异个变异），以确定患者能否受益于），以确定患者能否受益于Amgen公司的抗癌药物公司的抗癌药物Vectibix（panitumumab帕尼单抗帕尼单抗）。）。Vectibix于于2006年年9月首次获月首次获FDA批准，作为一种单药疗法，可用于批准，作为一种单药疗法，可用于野生型野生型KRAS和和NRAS基因的转移性结肠直基因的转移性结肠直肠癌患者肠癌患者。2017年年11月月15日日，FDA）批准纪念斯隆纪念斯隆凯特琳癌症研究中心凯特
35、琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，简称MSK）基于二代测序技术的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACT。MSK-IMPACT是一种基于高通测序检测原理，用于检测福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织（FFPE）样本中468种基因种基因突变及遗传变异突变及遗传变异。样本来源于实体瘤患者人群，可检测包含点突变点突变，小插入小插入和缺失缺失和微卫星不稳定性微卫星不稳定性。该产品作为一种肿瘤靶标的综合突变分析产品，明确不用于伴随诊断用途不用于伴随诊断用途，仅供纪念斯隆凯特琳癌症研究中心有资质的专业人员根据专业指南进行使用。研究中心有资质的专业人员
36、根据专业指南进行使用。日新月异日新月异日新月异日新月异2017年年11月月30日日，美国FDA宣布已批准Foundation Medicine公司针对多种实体瘤的下一代测序体外诊断（IVD）检测产品Foundation One CDx（F1CDx）。F1CDx的检测适用范围更加广泛，可检测324个基因个基因中的遗传变异，并可以在任何类型的实体瘤中获取两种基因组特征，包括微卫星不稳定性（微卫星不稳定性（MSI）和肿瘤突变负荷（肿瘤突变负荷（TMB），进而帮助临床医生进行临床管理。此外，对于五种类型的肿瘤，包括非非小细胞肺癌小细胞肺癌、黑色素瘤黑色素瘤、乳腺癌乳腺癌、结肠直肠癌结肠直肠癌和卵巢癌卵
37、巢癌，这款产品测试可以用作伴随诊断，以判断哪些患者可能受益于FDA批准的癌症靶向疗法。质量保证的关键点质量保证的关键点 检验申请单是合适的：对“Who”在“When”开出“What”申请单 标本是正确的和好的：采集、运送和保存采集、运送和保存 实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的避免（分区、温湿度、可能的干扰的避免（分区、灰尘、电磁、振动等）灰尘、电磁、振动等）仪器设备状态是好的：维护、定期校准维护、定期校准 试剂是好的：性能验证性能验证或性能确认、批质检性能确认、批质检 实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力评估外部和内部培训，能力评估 SOP的可操作性可操作性及全员遵循全员遵循
38、得到结果的过程是有监控的：室内质量控制室内质量控制和室间质量评价室间质量评价（或实验室间比对）针对差错差错、投诉投诉、失控失控等分析原因采取措施的质量持续改进分析原因采取措施的质量持续改进 临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗质量保证质量保证检测申请单、检测申请单、标本采集、标本采集、运送和保存运送和保存（分析（分析前）前）室内质控室内质控（分析中）（分析中）室间质评室间质评（分析中）（分析中）结果报告解结果报告解释及临床应释及临床应用（分析后）用（分析后）涉及临床医生标本采集环节和实验室涉及实验室涉及实验室涉及实验室人员和临床医生NGS的一般流程的一般流程患者标本处理核酸
39、提取片段化患者样本条码化（分子标签）外显子或基因盘靶基因富集接头连接文库制备流动池装载序列reads产生Wet bench对测序得到的短序列reads使用各种算法对一线性参比人类基因组序列进行比对核苷酸位点变异识别变异的临床相关分析变异注释结果报告结果报告及解释及解释生物生物信息信息学分学分析析（Dry bench）关键问题之一：可操作性的关键问题之一：可操作性的SOP及全员遵循及全员遵循?标准操作程序（标准操作程序（SOP）需有严格的标准操作程序，不能随意改变。WET BENCH ANALYTIC PROCESSNGS Wet Bench Process DocumentationThe L
40、aboratory Uses a Standard Operating Procedureto Document the Analytic Wet Bench Process Used toGenerate NGS Data.BIOINFORMATICS PROCESS NGS Bioinformatics Pipeline DocumentationThe Laboratory Uses an SOP to Document theBioinformatics Pipeline Used to Analyze,Interpret,and Report NGS Results.实验室质量管理的
41、实验室质量管理的“灵魂灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！SOP等于试剂盒说明书吗?标准操作程序（标准操作程序（SOP）是实验室的是实验室的“最高标准最高标准”！有有可操作性可操作性的的SOP及及全全员员遵循遵循是质量管理的“灵魂”！区域区域：EGFR基因基因 18、19、20、21号外显子号外显子 EGFR基因热点突变基因热点突变 EGFR基因全部外显子基因全部外显子 突变类型：突变类型：点突变点突变/短片段缺失短片段缺失/短片段插入短片段插入 融合基因融合基因 拷贝数变异拷贝数变异EGFR基因基因28个外显子个外显子E
42、GFR基因突变检测基因突变检测案例案例:高通量测序结果的判定高通量测序结果的判定 需有严格的试剂配制试剂配制和使用标准操作程序使用标准操作程序（Standard Operation Procedure,SOP）。通常包括核酸核酸提取提取、片段化片段化、文库制备文库制备、加入标签加入标签、混样混样、测序测序、生物信息学分析生物信息学分析和结果报告结果报告等步骤；对所有试剂原料的来源试剂原料的来源、试剂配制的过程试剂配制的过程、基因检测的区域基因检测的区域、软件及版本软件及版本、对照品对照品等均需详细说明，以及使用试剂进行检测的步骤检测的步骤，均需有试剂使用说明书或SOP，并且每次检测都按照SOP
43、来进行。在NGS检测中，需建立测序质量标准建立测序质量标准，且所有的性能指标均在相同的测序质量标准下进行评价。重要的质量标准有重要的质量标准有：最低测序深度最低测序深度（minimum coverage）、平均测序深度平均测序深度（average coverage）、测序均一性测序均一性（uniformity）、符合要求质量值的碱基百分比符合要求质量值的碱基百分比（如Q20百分比）、比对至靶向区域比对至靶向区域的的reads百分比百分比等。质量标准一旦建立质量标准一旦建立，所有的检测过程均需在此条件下进行，不得随意改变不得随意改变。例如例如实验室在建立LDTs和性能确认评价时，要求的最低测序深
44、度为最低测序深度为500，基于此质量标准基于此质量标准，检测下限检测下限（检测突变等位基因百分比）为5%，那么在临床检测中，最低测序深度为500的结果为有效结果，如果怀怀疑临床样本中有低于疑临床样本中有低于5%的突变，也不得随意增加测序深度的突变，也不得随意增加测序深度。可在SOP中，设立重新采集样本或者采用其它更敏感方法重复检测的程序。标准操作程序（标准操作程序（SOP）真阴性真阳性假阴性假阳性Hardwick SA,et al.Nat Rev Genet.2017NGS检测检测cut-off值的设定值的设定测序深度测序深度为为200时，有时，有10个突变个突变reads，报告，报告突变阳性
45、突变阳性，在，在不考虑概率以及其它因素的情况下，不考虑概率以及其它因素的情况下，突变频率突变频率=突变突变reads/测测序有效序有效reads（按照（按照200计算）计算）100%=5%；测序深度测序深度1000时，有时，有10个突变个突变reads，同样的，同样的，突变频率突变频率=突变突变reads/测序有效测序有效reads（按照（按照1000计算）计算）100%=1%。改变检测参数对改变检测参数对NGS结果的影响结果的影响降低判读阳降低判读阳性的最低reads数要求？提高测序深度？降低碱基质量值的要求？真阴性真阳性假阴性假阳性敏感性提高，特异性降低阳性结果中错误率大幅提高改变检测参数
46、对改变检测参数对NGS结果的影响结果的影响关键问题之二：性能确认（关键问题之二：性能确认（Validation）?NGS性能确认性能确认NGS Wet Bench Process ValidationThe Laboratory Validates the Analytic Wet BenchProcess and Revalidates the Entire Process and/orConfirms the Performance of the Components of theProcess as Satisfactory When Modifications Are Made.The
47、 Extent of Revalidation and/or Confirmation IsModification Dependent.NGS Bioinformatics Pipeline ValidationThe Laboratory Validates the Bioinformatics Pipelineand Revalidates the Entire Pipeline and/or Confirms thePerformance of the Components of the Pipeline asSatisfactory When Modifications Are Ma
48、de.The Extentof Revalidation and/or Confirmation Is ModificationDependent.NGS性能确认包括哪些方面？性能确认包括哪些方面？平台确认平台确认：确定平台鉴定：确定平台鉴定一大范围基因组区域一大范围基因组区域一些遗传变异一些遗传变异的能力的能力 检测方法确认检测方法确认：证明该检测方法能检出：证明该检测方法能检出满足其预期应用满足其预期应用的的具有临床意义具有临床意义的变异序列的变异序列u Analytical Validation 精密度（precision）：重复性研究 准确度（accuracy）：方法学比较研究 分析灵
49、敏度（analytical sensitivity）：测定下限（Limit of detection）研究 分析特异性（analytical specificity）：干扰物质（非特异基因非特异基因）研究 可报告范围（reportable range)：可测定的基因区域研究u Clinical Validation（通过患者人群研究得到通过患者人群研究得到）：临床敏感性、临床特异性、阳性预测值和阴性预测值 生物信息学分析确认生物信息学分析确认：明确要求提供准确的序列数据提供准确的序列数据和在靶向基因组区域内的变异在靶向基因组区域内的变异。生物信息学分析独立于检测系统，研发检测过程中，应对生物信
50、息学分析先于检测方法确认应对生物信息学分析先于检测方法确认，单独进行理想化单独进行理想化。Nat Biotechnol 2012，30(11):10331036文献中有一些会造成混淆或误解的概念文献中有一些会造成混淆或误解的概念 Analytical Validationu 准确度（准确度（accuracy）与总符合率（总符合率（overall percent agreement）：在方法学或与“金标准”的比较研究中两者的意义相同，计算公式为：计算公式为：TP（真阳性）（真阳性）+TN（真阴性）（真阴性）/Totalu分析灵敏度（分析灵敏度（analytical sensitivity）或灵敏
