1、1基因重组技术的发展基因重组技术的发展,不同微生物作为宿主不同微生物作为宿主表达蛋白质的生物产品成为可能。表达蛋白质的生物产品成为可能。大肠杆菌大肠杆菌成为最常用的一种外源基因表达成为最常用的一种外源基因表达工具，具有容易培养、生长繁殖快等特点。工具，具有容易培养、生长繁殖快等特点。酿酒酵母具有简单糖基化，高生长率，低酿酒酵母具有简单糖基化，高生长率，低蛋白酶及清晰的遗传体系等优点，应用也蛋白酶及清晰的遗传体系等优点，应用也较为广泛。较为广泛。缺陷：不能将产物高水平释放到培养基中；缺陷：不能将产物高水平释放到培养基中；不能解决胞内产物及包含体的问题。不能解决胞内产物及包含体的问题。2第一节第一
2、节 细胞分离细胞分离生物悬浮液生物悬浮液大部分是水大部分是水其次是微生物和动、植物或碎片及少量其次是微生物和动、植物或碎片及少量未用完的培养基未用完的培养基第三部分是代谢产物第三部分是代谢产物3一、过滤一、过滤 概念概念：利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体：利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法称为过滤。颗粒，进行固液分离的方法称为过滤。是在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒是在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下。的溶液，使液体通过，固体颗粒留下。是固液分离的常用是固液分离的常用方法方法之一。之一。根据被分离的物质颗粒大小，分为一
3、般过滤和膜根据被分离的物质颗粒大小，分为一般过滤和膜过滤。过滤。4影响过滤的因素影响过滤的因素v菌种：真菌，放线菌，细菌菌种：真菌，放线菌，细菌v培养基：黄豆，花生，淀粉培养基：黄豆，花生，淀粉v发酵时间：菌丝自溶前放罐发酵时间：菌丝自溶前放罐5改善过滤方法改善过滤方法v助滤剂：质地坚硬不可压缩性固体助滤剂：质地坚硬不可压缩性固体v机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构v使用方法：使用方法：a a 预先制成滤饼预先制成滤饼b b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤助滤剂混入悬浮液中一起过滤6v常用助滤剂：常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性碳硅藻土，珍珠岩，活性碳v应
4、用优化因素：应用优化因素：a a 单位质量助滤剂的滤液最大产量单位质量助滤剂的滤液最大产量 b b 使用周期使用周期 c c 流速流速 7滤饼滤饼传统的过滤传统的过滤8 过滤设备从传统的板框式过滤机到旋转过滤设备从传统的板框式过滤机到旋转式真空过滤设备，种类很多。式真空过滤设备，种类很多。9板框式过滤机板框式过滤机10螺旋式过滤机螺旋式过滤机11沉降：固体颗粒在外力作用下与液体物质作相对运沉降：固体颗粒在外力作用下与液体物质作相对运动最终实现固液分离的细胞分离技术。动最终实现固液分离的细胞分离技术。重力沉降重力沉降:指当悬浮液静置时，密度较大的固体颗粒在重力指当悬浮液静置时，密度较大的固体颗粒
5、在重力的作用下逐渐下沉的作用下逐渐下沉 通常十分缓慢通常十分缓慢二、离心沉降二、离心沉降是化工过程中常用的气固、液是化工过程中常用的气固、液固分离的手段。也是下游加工固分离的手段。也是下游加工过程的基本分离技术。过程的基本分离技术。12重力沉降式液固分离设备重力沉降式液固分离设备13菌体细胞体积小，沉降慢，先将其细胞凝菌体细胞体积小，沉降慢，先将其细胞凝聚成较大凝聚体颗粒后再进行沉降操作。聚成较大凝聚体颗粒后再进行沉降操作。方法：中性盐方法：中性盐 高分子絮凝剂高分子絮凝剂14离心沉降离心沉降 概念概念：利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮：利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的
6、一项分离、浓缩或提取力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取操作。操作。利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离力场中迅速沉降分层，实现固液分离 操作方式：间歇式、连续式操作方式：间歇式、连续式 型式：管式、套筒、碟片式型式：管式、套筒、碟片式针对固体颗粒小、液体粘度大、过滤速度慢甚针对固体颗粒小、液体粘度大、过滤速度慢甚至难以过滤的悬浮液有效。同时对于忌用助滤至难以过滤的悬浮液有效。同时对于忌用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离，也会得剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离，也会得到较好的效果。到较好的效果。15大型离心机大
7、型离心机小型离心机小型离心机16使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液液是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高适用于菌体细胞、血球、胞内细胞器、病毒以及适用于菌体细胞、血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分离，应用于液液相间的分离。蛋白质的分离，应用于液液相间的分离。离离 心心 分分 离离17离心分离离心分离离心分离模式图离心分离模式图18悬浮液中的固体粒子主要受三个力作用，悬浮液中的固体粒子主要受三个力作用，浮力、粘滞力和重力
8、。要使固体和液体分浮力、粘滞力和重力。要使固体和液体分离，必须克服粘滞力的束缚是主要方面。离，必须克服粘滞力的束缚是主要方面。只须提高离心加速度（转数），即可获得只须提高离心加速度（转数），即可获得较好的分离效果。较好的分离效果。19 差速离心差速离心 在密度均一的介质中由低速到高速逐级在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器,以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离。又称一级分级分离。心分离。又称一级分级分离。离心分离法离心分离法2021密度梯度离心密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成
9、一连续或不用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心场作用使细胞分的顶部，通过重力或离心场作用使细胞分离。离。介质：蔗糖、氯化铯、多聚蔗糖介质：蔗糖、氯化铯、多聚蔗糖2223离心过滤：离心过滤：将料液送入有孔的转鼓中结合离心力作用将料液送入有孔的转鼓中结合离心力作用进行过滤。进行过滤。以离心力为推动力完成过滤操作，兼有离以离心力为推动力完成过滤操作，兼有离心和过滤双重作用。分离效率远高于单独心和过滤双重作用。分离效率远高于单独离心或过滤。离心或过滤。24（1）管式离心机）管式离心机 最简单，可提供较大离心力
10、最简单，可提供较大离心力 可用冷却水冷却可用冷却水冷却 悬浮液由管底进，澄清液由管口流出悬浮液由管底进，澄清液由管口流出离心分离设备离心分离设备25（2）碟片式离心机）碟片式离心机 有许多等间隔的碟形分离板有许多等间隔的碟形分离板 沉降面积大沉降面积大 转数较低，转数较低，10000转转/分分碟片式离心机碟片式离心机26第二节第二节 细胞破碎细胞破碎条件：条件：目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质在细胞尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质在细胞内沉积。内沉积。产物包裹在生物体内，属胞内产物。胞内产物与产物包裹在
11、生物体内，属胞内产物。胞内产物与培养液的隔离是由于培养液的隔离是由于细胞壁细胞壁和和细胞膜细胞膜等屏障引起等屏障引起的，细胞破碎就是要除去此屏障，释放胞内产物。的，细胞破碎就是要除去此屏障，释放胞内产物。27一、细胞壁结构一、细胞壁结构细胞的结构细胞的结构细胞破碎细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。其中其中细胞壁细胞壁的破碎最为关键。主要是破的破碎最为关键。主要是破碎细胞壁网状结构的碎细胞壁网状结构的共价键共价键。28细胞壁细胞壁29细菌的细胞壁不是坚硬的刚性球体，而是颇细菌的细胞壁不是坚硬的刚性球体，而是颇具
12、弹性的。绷得紧紧的原生质会使细胞产生具弹性的。绷得紧紧的原生质会使细胞产生一定的坚韧度。一定的坚韧度。细菌的细胞壁经酸性水解后，可得到如下产物细菌的细胞壁经酸性水解后，可得到如下产物(1)(1)肽聚糖；肽聚糖；(2)(2)氨基酸；氨基酸；(3)(3)磷壁酸；磷壁酸；(4)(4)糖糖类；类；(5)(5)脂质脂质（一）细菌3031概念：肽聚概念：肽聚糖是由糖是由 N乙乙酰胞壁酸酰胞壁酸（NAM）和和N乙酰葡糖乙酰葡糖胺胺（NAG）以以及短肽链（主及短肽链（主要是四肽）组要是四肽）组成的亚单位聚成的亚单位聚合而成的大分合而成的大分子聚合物。子聚合物。细胞壁的基本骨架细胞壁的基本骨架肽聚糖（共有成分）
13、肽聚糖（共有成分）32G+菌的细胞壁肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan):磷壁酸磷壁酸(teichoic acid)细胞壁厚度细胞壁厚度 较厚，较厚，2030nm细胞壁分层细胞壁分层 不分层不分层肽聚糖含量肽聚糖含量 含量高（含量高（30-70）肽聚糖层数肽聚糖层数 层数多层数多交联度交联度 交联度高交联度高磷壁酸磷壁酸 有有脂多糖脂多糖 无无DAP 无无33G的细胞壁细胞壁厚度细胞壁厚度 较薄较薄10-15nm细胞壁分层细胞壁分层 分层：分层：外壁层外壁层 6-10nm 内壁层内壁层2-3nm肽聚糖含量肽聚糖含量 只占组分的只占组分的5-10%肽聚糖层数肽聚糖层数 低，一般低，一般1-
14、2层层肽聚糖交联度肽聚糖交联度 较低较低磷壁酸磷壁酸 无无脂多糖脂多糖 有有 抗原决定因子抗原决定因子 O-抗原抗原 蛋白质蛋白质34LPS层的主要功能构成某些革兰氏阴性细菌致病物质构成某些革兰氏阴性细菌致病物质内毒素内毒素的物质基础；的物质基础；起细菌自我保护作用，它可以阻止溶菌酶、起细菌自我保护作用，它可以阻止溶菌酶、抗生素和染料等侵入菌体，也可以阻止周质空抗生素和染料等侵入菌体，也可以阻止周质空间中的酶外漏；间中的酶外漏；作为重要的抗原因子决定了革兰氏阴性菌抗作为重要的抗原因子决定了革兰氏阴性菌抗原的多样性；原的多样性；是许多噬菌体吸附的受体。是许多噬菌体吸附的受体。35 酵母和真菌的细
15、胞壁见酵母和真菌的细胞壁见图，在电子显微镜下观图，在电子显微镜下观察呈纤丝状，约察呈纤丝状，约60nm60nm厚，厚，厚度取决于生长条件特厚度取决于生长条件特别是碳源的类别。其细别是碳源的类别。其细胞壁水解可得到下列产胞壁水解可得到下列产物。糖及其氨基衍生物。糖及其氨基衍生物物(主要是葡萄糖、甘露主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和糖、半乳糖、岩藻糖和葡萄糖胺葡萄糖胺)；氨基酸，氨基酸，主要是谷氨酸和天冬氨主要是谷氨酸和天冬氨酸；酸；脂质。脂质。（二）真菌和酵母真菌和酵母363738外层：甘露聚糖（外层：甘露聚糖（约占约占30%30%，以，以-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）糖苷键联结（并非
16、所有酵母菌都有）内层：葡聚糖（内层：葡聚糖（约占约占30-40%30-40%，由，由D-D-葡萄糖以葡萄糖以-糖苷键联结）糖苷键联结）中间层：蛋白质（中间层：蛋白质（含含6-8%，多为酶类），多为酶类）细胞壁细胞壁a.a.细胞壁结构：细胞壁结构：酵母细胞壁呈酵母细胞壁呈“三明治三明治”结结构构酵母细胞的细胞壁酵母细胞的细胞壁 39b.b.壁外成分：壁外成分：有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。构。包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。c.c.细胞壁的少量组分细胞壁的少量组分脂类和几丁质（脂类和几丁质（chitin)chi
17、tin)：为聚乙酰氨基葡萄糖为聚乙酰氨基葡萄糖 几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵母含母含1 12%2%，有的假菌丝酵母含量超过了，有的假菌丝酵母含量超过了2%2%。4041（三）植物细胞壁植物细胞壁植物细胞壁由植物细胞壁由胞间层、初生壁、次生壁胞间层、初生壁、次生壁组组成。胞间层位于两个相邻细胞之间，为两成。胞间层位于两个相邻细胞之间，为两细胞共有的一层膜；随着细胞生长，原生细胞共有的一层膜；随着细胞生长，原生质分泌纤维素、果胶质及结构蛋白，形成质分泌纤维素、果胶质及
18、结构蛋白，形成初生壁；初生壁内继续积累纤维素和半纤初生壁；初生壁内继续积累纤维素和半纤维素，称为次生壁。维素，称为次生壁。42二、细胞破碎动力学二、细胞破碎动力学细胞破碎的目的：细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大其通透性，使细胞内的目标或破碎，增大其通透性，使细胞内的目标产物得到释放。产物得到释放。43破碎率的评价破碎率的评价直接计数：直接计数：直接计数法直接计数法 直接对适当稀直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最
19、终染色细胞的计数。来实现最终染色细胞的计数。（1 1）计数器）计数器 （2 2）平板计数）平板计数 （3 3）显微镜）显微镜44间接计数法间接计数法 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量浮液中细胞释放出来的化合物的量 (例如可溶性蛋例如可溶性蛋白、酶等白、酶等)。破碎率可通过被释放出来化合物的量与。破碎率可通过被释放出来化合物的量与所有细胞的理论最大释放量之比进行计算。通常做所有细胞的理论最大释放量之比进行计算。通常做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体(完整细完整细胞和碎片胞和碎片)，然后对清液
20、进行含量或活性分析。，然后对清液进行含量或活性分析。间接计数法最常用的细胞内含物是蛋白质，特别间接计数法最常用的细胞内含物是蛋白质，特别是酶活性释放到基质中，是破碎程度很好的指示参是酶活性释放到基质中，是破碎程度很好的指示参数。数。（1 1）活性测定活性测定（2 2）电导率测定：破碎后，带电荷的内容物释放，使悬电导率测定：破碎后，带电荷的内容物释放，使悬浮液的导电率增加。浮液的导电率增加。45细胞破碎率：细胞破碎率：%100%00NNNX随着破碎的进行，随着破碎的进行，N不断发生变化，而不断发生变化，而N0是恒是恒定不变的，因此破碎率也不断发生改变。定不变的，因此破碎率也不断发生改变。46三、
21、细胞破碎方法三、细胞破碎方法主要采用各种机械破碎法和化学破碎法，或机主要采用各种机械破碎法和化学破碎法，或机械破碎法和化学破碎法相结合。械破碎法和化学破碎法相结合。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力。力和剪切力。化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁，形成物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质
22、。释放胞内物质。47压挤压挤48化学渗透化学渗透49产物释放产物释放50方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例机械法机械法匀浆法（片型）匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈细胞被搅拌器劈碎碎适中适中适中适中动物组织及动物组织及动物细胞动物细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨细胞被研磨物磨碎碎适中适中便宜便宜超声波法超声波法用超声波的空穴用超声波的空穴作用使细胞破碎作用使细胞破碎适中适中昂贵昂贵细胞悬浮液细胞悬浮液小规模处理小规模处理匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）须使细胞通过的须使细胞通过的小孔，使细胞受小孔，使细胞受到剪切力而破碎到剪切力而破碎剧烈剧烈适中适中细胞悬浮液细胞悬浮液大规模处理大规模处理
23、珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或细胞被玻璃珠或铁珠捣碎铁珠捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液细胞悬浮液和植物细胞和植物细胞的大规模处的大规模处理理 细胞物理破碎法细胞物理破碎法51方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例化学法化学法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜血红细胞的血红细胞的破坏破坏酶消化法酶消化法细胞壁被消化，细胞壁被消化，使细胞破碎使细胞破碎温和温和昂贵昂贵增溶法增溶法表面活性剂溶解表面活性剂溶解细胞壁细胞壁温和温和适中适中胆盐作用于胆盐作用于大肠杆菌大肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳胞壁并使之失稳适中适中便宜便宜甲苯破
24、碎酵甲苯破碎酵母细胞母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使碱的皂化作用使细胞壁融解细胞壁融解剧烈剧烈便宜便宜 细胞化学破碎法细胞化学破碎法52（一）机械破碎（一）机械破碎主要有主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎和超声波破碎和超声波破碎特点：处理量大，破碎效率高，速度快。特点：处理量大，破碎效率高，速度快。5354(1)(1)珠磨法珠磨法 1)1)结构与原理结构与原理-见图（见图（P35P35）2)2)破碎率动力学方程式破碎率动力学方程式 3)3)适用范围和操作注意点适用范围和操作注意点 大多数微生物的细胞破碎大多数微生物的细胞破碎将细胞在珠磨机中破碎被认为是最有效的一
25、种将细胞在珠磨机中破碎被认为是最有效的一种细胞物理破碎法细胞物理破碎法。破碎微生物细胞用的珠磨机。破碎微生物细胞用的珠磨机有多种形式。有多种形式。55动力分离器，可调节其缝隙动力分离器，可调节其缝隙搅拌磨简图在这类设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和珠子在这类设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和珠子相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动引起的。破碎作用将遵循一级动力学定律。动引起的。破碎作用将遵循一级动力学定律。56珠磨珠磨57影响破碎效果的因素：影响破碎效果的因素：磨珠大小、搅拌速度、流量、细胞浓度、磨珠大小、搅
26、拌速度、流量、细胞浓度、装珠量、温度等。要想获得一个最大破碎装珠量、温度等。要想获得一个最大破碎率，要有较高的装珠量、较高的搅拌速度、率，要有较高的装珠量、较高的搅拌速度、较小的磨珠直径和适中的细胞浓度。较小的磨珠直径和适中的细胞浓度。珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，随珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，随搅拌速度和悬浮液停留时间的增大而增大。搅拌速度和悬浮液停留时间的增大而增大。珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎。珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎。58对于释放胞内酶而言，细胞完全破碎是不对于释放胞内酶而言，细胞完全破碎是不必要的，胞内酶的释放速率取决于其在细必要的，胞内酶的释放速率取决
27、于其在细胞中的位置；细胞浓度对破碎过程有着非胞中的位置；细胞浓度对破碎过程有着非常重要的影响，一般通过响应曲面法分析常重要的影响，一般通过响应曲面法分析优化，得到一个最佳细胞浓度和珠磨时间。优化，得到一个最佳细胞浓度和珠磨时间。59WSK卧式高效全能珠磨机60ZM系列卧式密闭珠系列卧式密闭珠(砂砂)磨机磨机61(2)(2)高压匀浆法高压匀浆法1 1）结构和原理）结构和原理高压匀浆器，由高压泵和匀高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。见图浆阀组成。见图62原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上
28、，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力的综合低压环境，从而在撞击力和剪切力的综合作用下破碎。作用下破碎。操作压力：操作压力：505070MPa63剪切剪切64JJ-2组织捣碎匀浆机 652)影响破碎率的因素影响破碎率的因素（P36P36图）图）max)2(11ln11ln2RRSNukSNkpSbaba3)适用范围和操作注意点适用范围和操作注意点酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到到20%左右，团状和丝状及小的左右，团状和丝状及小的G+菌不适。菌不适。压力压力循环操作次数循环
29、操作次数温度温度细胞浓度细胞浓度细胞生长速率细胞生长速率 66不同生长期的细胞以及不同培养条件下得不同生长期的细胞以及不同培养条件下得到的细胞在相同破碎条件下的破碎效果也到的细胞在相同破碎条件下的破碎效果也不一样。破碎效率随细胞比生长速率减小不一样。破碎效率随细胞比生长速率减小而降低。主要原因是缓慢的生长条件更适而降低。主要原因是缓慢的生长条件更适合细胞发育成坚硬的细胞壁。合细胞发育成坚硬的细胞壁。对料液作冷却处理，保护目标产物的活性。对料液作冷却处理，保护目标产物的活性。67撞击撞击(3)(3)喷雾撞击破碎喷雾撞击破碎68 细胞是弹性体，难于破碎，将其冷冻成为细胞是弹性体，难于破碎，将其冷冻
30、成为刚性球体，可以降低破碎难度。刚性球体，可以降低破碎难度。悬浮液以喷雾状高速冻结，形成微粒子，悬浮液以喷雾状高速冻结，形成微粒子，在高速载气作用下送入破碎室，高速撞击在高速载气作用下送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。撞击板，使冻结的细胞发生破碎。69 声频高于声频高于151525KHZ25KHZ的超声波在高强度声能输的超声波在高强度声能输入下，利用空化现象引起的冲击波和剪切力使入下，利用空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。细胞破碎。超声波超声波气泡形成气泡形成气泡长大气泡长大破碎破碎超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型均影
31、响破碎效率。及菌种类型均影响破碎效率。缺点：产生化学自由基团缺点：产生化学自由基团氧化产物，且噪氧化产物，且噪声大。声大。(4)(4)超声波破碎超声波破碎70作用原理：作用原理：将电能通过换能器转换为声能，这种能量将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质变成一个个密集的小气泡，通过液体介质变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生象小炸弹一样这些小气泡迅速炸裂，产生象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞的作用。的能量，从而起到破碎细胞的作用。71超声波破碎过程的效率受下列几个参数影响：超声波破碎过程的效率受下列几个参数影响：(1)(1)振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质振幅：振幅
32、直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度。释放的比速度。(2)(2)细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象制空穴现象。72(3)(3)表面张力：添加表面活性剂或从细胞中释表面张力：添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质放出表面活性物质(如蛋白质如蛋白质)，能显著地，能显著地影响声波破碎效率。因为强烈气泡在气影响声波破碎效率。因为强烈气泡在气-液液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除。界面上会促使蛋白质变性和空穴清除。(4)(4)被处理悬浮液的体积：大体积需要高的被处理悬浮液的体积：大体积需要高的声能引起强烈的涡流和大的气泡形成。声能引起强烈的涡流和大的
33、气泡形成。73(5)(5)细胞悬浮液的流速。细胞悬浮液的流速。声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，在许多实验室研究或生化物质的分离制备在许多实验室研究或生化物质的分离制备中都能见到，但是要向大量细胞悬浮液中中都能见到，但是要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的，故在工业范通入足够的能量是很困难的，故在工业范围中还未采用这种方法。围中还未采用这种方法。74超声破碎超声破碎75超声波超声波超声波破碎仪超声波破碎仪 7677(5)(5)其他类型机械破碎法其他类型机械破碎法X-pressX-press法法：将浓缩的细胞悬浮液低温冷却：将浓缩的细胞悬浮液低温冷却
34、形成冰晶，再施以高压，高压力冲击造成形成冰晶，再施以高压，高压力冲击造成冰晶磨损使细胞破裂。冰晶磨损使细胞破裂。微波法微波法：胞内物质局部受热，内压升高使：胞内物质局部受热，内压升高使细胞表面出现孔洞或裂纹，小分子能够出细胞表面出现孔洞或裂纹，小分子能够出入细胞，细胞仍保持其形态。此法处理蛋入细胞，细胞仍保持其形态。此法处理蛋白质分子三维结构随微波场方向变化而被白质分子三维结构随微波场方向变化而被破坏，蛋白质分子缠绕成球，改变溶解性，破坏，蛋白质分子缠绕成球，改变溶解性，便于包含体中重组蛋白的回收。便于包含体中重组蛋白的回收。78（二）化学和生物化学渗透（二）化学和生物化学渗透酸碱法酸碱法 加
35、入酸或碱调节溶液加入酸或碱调节溶液pHpH值，改变两性物质值，改变两性物质的电荷性，从而使蛋白质之间或蛋白质与的电荷性，从而使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力下降而易于溶其他物质之间的相互作用力下降而易于溶解。解。盐法：盐法：高浓度盐可产生高的渗透压，破坏细胞高浓度盐可产生高的渗透压，破坏细胞壁的通透性，使细胞失水，质壁分离，造壁的通透性，使细胞失水，质壁分离，造成细胞自身破裂释放出内容物（化学渗透成细胞自身破裂释放出内容物（化学渗透学说）。学说）。79酶溶法酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压
36、冲击等方法到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法进一步破坏。进一步破坏。酶的主要作用是破坏细胞壁上特殊的键，从而达酶的主要作用是破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。到破碎目的。优点：条件温和，能选择性释放产物，胞内核酸优点：条件温和，能选择性释放产物，胞内核酸等泄出量少，细胞外形完整，便于后步分离。等泄出量少，细胞外形完整，便于后步分离。缺点：酶水解价格高，只适用于小规模应用。缺点：酶水解价格高，只适用于小规模应用。80 除上述外，可采用的酶还有其他类型的蛋白酶、脂除上述外，可采用的酶还有其他类型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明质酸酶等。肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明质酸酶等。重要微
37、生物细胞壁的降解酶81表面活性剂处理：表面活性剂处理：表面活性剂作用于与膜结合的蛋白质，形表面活性剂作用于与膜结合的蛋白质，形成胶束而溶解膜，使细胞破碎。如成胶束而溶解膜，使细胞破碎。如SDSSDS有机溶剂法：有机溶剂法：又称脂溶法。使用有机溶剂可使细胞壁膜又称脂溶法。使用有机溶剂可使细胞壁膜溶胀而破碎，使胞内物质释放出来。如甲溶胀而破碎，使胞内物质释放出来。如甲苯苯82变性剂法变性剂法 加入变性剂，可削弱氢键作用，使胞内产物相互加入变性剂，可削弱氢键作用，使胞内产物相互之间的作用力减弱而易于释放。如盐酸胍。之间的作用力减弱而易于释放。如盐酸胍。温和化学渗透剂处理温和化学渗透剂处理 渗透剂一般
38、采用分子量较小的非极性甘氨酸、丙氨渗透剂一般采用分子量较小的非极性甘氨酸、丙氨酸，其更易渗透到细胞壁中，通过氢键、范德华酸，其更易渗透到细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构，从力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构，从而改变细胞的通透性。同时能维持而改变细胞的通透性。同时能维持ADHADH的高活性，的高活性，有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。83（三）物理破碎法（三）物理破碎法冻融法冻融法 将细胞冻结后再融化。破坏细胞膜的疏水键，增将细胞冻结后再融化。破坏细胞膜的疏水键，增加亲水性和通透性。同时由于细胞内水结晶使细加亲水性和通透性。同时由于细胞内水结晶使细胞内外产
39、生浓度差，而导致渗透压产生，并且细胞内外产生浓度差，而导致渗透压产生，并且细胞内形成的冰晶也会破坏细胞壁。胞内形成的冰晶也会破坏细胞壁。低温玻璃化法低温玻璃化法 低温断裂是从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、低温断裂是从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分破坏。避免了高温高压、强酸强碱细胞膜等成分破坏。避免了高温高压、强酸强碱对营养活性成分的破坏。对营养活性成分的破坏。84（四）其他破碎方法（四）其他破碎方法烈性噬菌体裂解细胞，但不可控。烈性噬菌体裂解细胞，但不可控。温和噬菌体可控，应用较多。温和噬菌体可控，应用较多。将噬菌体将噬菌体DNADNA整合到大肠菌的染色体上以获整合到大肠菌的染色体
40、上以获得溶源菌，利用溶源菌中的噬菌体来裂解得溶源菌，利用溶源菌中的噬菌体来裂解细胞壁以使细胞内产物释放。此法只在细细胞壁以使细胞内产物释放。此法只在细胞对数生长期的中前期效果明显。但对于胞对数生长期的中前期效果明显。但对于大多数产品来说，在细胞中积累达到最大大多数产品来说，在细胞中积累达到最大量时期往往是稳定期或对数生长期的后期。量时期往往是稳定期或对数生长期的后期。85（五）各种破碎方法的比较及选择（五）各种破碎方法的比较及选择 细胞破碎方法都有其局限性，单独运用细胞破碎方法都有其局限性，单独运用一种方法往往不能达到理想的效果，需将一种方法往往不能达到理想的效果，需将几种不同的方法结合使用，
41、以达到交破碎几种不同的方法结合使用，以达到交破碎率与高产物活性的目的。率与高产物活性的目的。86选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据(1)(1)细胞的处理量细胞的处理量(2)(2)细胞壁的强度和结构细胞壁的强度和结构(3)(3)目标产物对破碎条件的敏感性目标产物对破碎条件的敏感性(4)(4)破碎程度破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率，低适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡87破碎技术研究的方向(1)(1)多种破碎法的结合多种破碎法的结合(2)(2)与上游技术结合与上游技术结合(3)(3)与下游操作技术结合与下游操作
42、技术结合88目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放 破碎细胞的目的是要得到一种或几种有用破碎细胞的目的是要得到一种或几种有用的目标产物，在细胞内存在的很多物质中，的目标产物，在细胞内存在的很多物质中，选择性释放目标产物，而使其他物质尽量少选择性释放目标产物，而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，对后面的操作是很有必要的。对后面的操作是很有必要的。(1)(1)仅破坏或破碎目标产物的位置周围仅破坏或破碎目标产物的位置周围 (2)(2)选择性溶解目标产物选择性溶解目标产物89第三节第三节 胞内产物的溶解及复性胞内产物的溶解及复性利用微生物
43、大规模生产蛋白质药物或多肽，利用微生物大规模生产蛋白质药物或多肽，成为一个有效的蛋白质生产新途径，其中成为一个有效的蛋白质生产新途径，其中以大肠杆菌为宿主最为常用。以大肠杆菌为宿主最为常用。大肠杆菌中高效表达的蛋白质常在胞内聚大肠杆菌中高效表达的蛋白质常在胞内聚集，形成不可溶、无生物活性的包含体。集，形成不可溶、无生物活性的包含体。包含体必须经过变性、复性才能获得生物包含体必须经过变性、复性才能获得生物学功能。学功能。90一、包含体及其形成一、包含体及其形成包含体是聚集蛋白形成的浓密颗粒，在适当条件包含体是聚集蛋白形成的浓密颗粒，在适当条件下，其中蛋白可达细胞中总蛋白的下，其中蛋白可达细胞中总
44、蛋白的50%50%甚至更多。甚至更多。包含体中主要是重组蛋白，几乎不含宿主蛋白、包含体中主要是重组蛋白，几乎不含宿主蛋白、核糖体组分或核糖体组分或DNADNA、RNARNA片段。片段。包含体是蛋白的沉积与溶解的不平衡状态形成的包含体是蛋白的沉积与溶解的不平衡状态形成的一种动力学结构。包含体蛋白的聚体是个可逆过一种动力学结构。包含体蛋白的聚体是个可逆过程，蛋白质水平的表达、蛋白质形成错误的二硫程，蛋白质水平的表达、蛋白质形成错误的二硫键、重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏相应的键、重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏相应的翻译后加工功能，蛋白折叠过程中缺乏酶和辅助翻译后加工功能，蛋白折叠过程中缺乏酶和
45、辅助因子等是包含体形成的主要原因。因子等是包含体形成的主要原因。91二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和溶解包含体蛋白没有生物活性，需要有效的溶包含体蛋白没有生物活性，需要有效的溶解、折叠和纯化工艺恢复其活性。解、折叠和纯化工艺恢复其活性。细胞破碎后，分离出来的包含体中主要是细胞破碎后，分离出来的包含体中主要是重组蛋白，也含有上些细胞碎片、膜蛋白、重组蛋白，也含有上些细胞碎片、膜蛋白、脂类、核酸及其他杂质，需要进行分离。脂类、核酸及其他杂质，需要进行分离。包含体密度较大，用低速离心即可分离纯包含体密度较大，用低速离心即可分离纯化。化。92包含体中重组蛋白处于错误折叠状态包含体中重组蛋白处于
46、错误折叠状态,主要靠非共主要靠非共价键连接，唯一的共价键是二硫键，因此要获得价键连接，唯一的共价键是二硫键，因此要获得正确的折叠首先要破坏二硫键和非共价键。正确的折叠首先要破坏二硫键和非共价键。方式：蛋白质解体变性，不溶的聚体成为可溶性方式：蛋白质解体变性，不溶的聚体成为可溶性蛋白。强变性剂破坏次级键，引起构象解体。去蛋白。强变性剂破坏次级键，引起构象解体。去污剂与蛋白质疏水区作用，避免蛋白形成疏水核污剂与蛋白质疏水区作用，避免蛋白形成疏水核心。二者共同作用可以引起包含体解聚和溶解。心。二者共同作用可以引起包含体解聚和溶解。还原剂有助于半胱氨酸维持还原态，可防止碱性还原剂有助于半胱氨酸维持还原
47、态，可防止碱性条件下形成二硫键而聚集。螯合剂可防止金属催条件下形成二硫键而聚集。螯合剂可防止金属催化的半胱氨酸空气氧化。化的半胱氨酸空气氧化。93三、蛋白质复性三、蛋白质复性变性剂去除或浓度降低后，蛋白质会自发变性剂去除或浓度降低后，蛋白质会自发地从不稳定状态向稳定状态转变，形成具地从不稳定状态向稳定状态转变，形成具有生物学活性的天然结构。有生物学活性的天然结构。复性步骤：复性步骤：包含体自大肠杆菌中分离；包含体自大肠杆菌中分离；聚集蛋白的溶解；聚集蛋白的溶解；溶解蛋白的折叠和纯化。溶解蛋白的折叠和纯化。94（一）蛋白质复性方法（一）蛋白质复性方法1、稀释与透析复性法、稀释与透析复性法（1）稀
48、释复性：将变性蛋白质溶液直接加入到复）稀释复性：将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成天然构象。使蛋白质折叠成天然构象。优点：操作简单、快速。是目前最常用的蛋白质优点：操作简单、快速。是目前最常用的蛋白质复性方法之一。复性方法之一。缺点：变性蛋白质会发生错误折叠或重新形成聚缺点：变性蛋白质会发生错误折叠或重新形成聚集体，造成复性率下降。集体，造成复性率下降。改进：将变性蛋白质加入到复性液中。改进：将变性蛋白质加入到复性液中。现状：需大容器、大量缓冲液和浓缩，成本较高，现状：需大容器、大量缓冲液和浓缩，成本较
49、高，不适用于大规模。不适用于大规模。95（2）透析复性：将变性蛋白质装入透析袋）透析复性：将变性蛋白质装入透析袋中，对复性缓冲液进行透析。也是基于去中，对复性缓冲液进行透析。也是基于去除变性剂的机理使蛋白质复性。除变性剂的机理使蛋白质复性。特点：透析过程主要是扩散作用，需时间特点：透析过程主要是扩散作用，需时间较长，易造成蛋白质聚集。较长，易造成蛋白质聚集。改进：缓慢透析法，使变性剂浓度下降连改进：缓慢透析法，使变性剂浓度下降连续，不会出现变性剂浓度突变，可减少蛋续，不会出现变性剂浓度突变，可减少蛋白质复性中产生沉淀，提高活性蛋白效率。白质复性中产生沉淀，提高活性蛋白效率。962、色谱复性技术
50、、色谱复性技术（1）凝胶过滤色谱）凝胶过滤色谱 也称体积排阻色谱，可实现变性剂去除也称体积排阻色谱，可实现变性剂去除与蛋白质复性同时进行。与蛋白质复性同时进行。采用适宜大小的凝胶过滤体系，根据折采用适宜大小的凝胶过滤体系，根据折叠中间体的半径，通过捕获其不同形式将叠中间体的半径，通过捕获其不同形式将蛋白分子相互分开，减少中间体的相互作蛋白分子相互分开，减少中间体的相互作用，提高复性率。梯度缓冲液可有效增加用，提高复性率。梯度缓冲液可有效增加活性蛋白质得率。活性蛋白质得率。97（2）吸附色谱）吸附色谱 利用色谱固相介质对变性蛋白的吸附作利用色谱固相介质对变性蛋白的吸附作用，将其固定在介质表面，使
