1、软珊瑚Sarcophyton tortuosum内生真菌SarcoF5代谢产物研究报告人：蔡永通指导老师：李厚金副教授图1 扭曲肉芝软珊瑚的照片海底照片水上照片实验背景一、软珊瑚Sarcophyton tortuosum 1986年本院天然室的苏镜娱等从软珊瑚Sarcophyton tortuosum中得到2个罕见的四环四萜化合物；2004年中山大学药学院蓝文健等又从该软珊瑚分离得到3个新的四萜化合物。发表的文章：1 J.Y.Su,T.S.Peng et a1.Studies on the Chinese Soft Coral,The Structure of Methyl sartortuo
2、ate.Acta Chem.sinica,1986,1,101.2 Jingyu Su,kanghou Long,Tangsheng Pang.The Structure of Methyl Isosartortuoate,a Novel Tetracyclic Tetraterpenoid from the Soft Coral Sarcophy tontortuosum.J.Am.Chem.Soc.1986,108,177.3 Jingyu Su,Kanghou Long,Tangshen Peng et al.,Determination of Molecular and Crystal
3、 Stucture of a Unique New Tetraterpenoid-Methyl Sartotuoate.Science Sinica(SeriesB),1988,10,1172.4 Zeng Long-Mei,Lan Wen-Jian,Su Jing-Yu,Zhang Guang-Wen,Feng Xiao-Long,Liang Yong-Ju,Yang Xiao-Ping.Two new cytotoxic tetracyclic tetraterpenoids from the soft coral Sarcophyton tortuosum.Journal of Natu
4、ral Products.2004,67(11),1915-8.5 Lan W-J,Li H-J,Yan S-J,Su J-Y,Zeng L-M.New tetraterpenoid from the soft coral Sarcophyton tortuosum.Journal of Asian Natural Products Research.2007,9(3-5),267-271.OOHCOOCH3HOHOOOHmethyl sartortuoateOOOHCOOCH3Omethyl isosartortuoateOHOHOOHCOOCH3HOHOOmethyl tortuoate
5、AHOHOOOHCOOCH3Omethyl tortuoate BOHOHOHOOHCOOCH3Omethyl tortuoate COHHOHOH图2 四萜结构图(1)以上分离得到的四萜化合物对老鼠S180，CNE-2，P-388，HT-29，CNE-1显示了不同程度的抑制作用。化合物活性 因为这些四萜化合物具有显著的抗癌活性，因此在医药方面有很好的应用价值，但是因为其结构复杂，合成比较困难，因此对寻找其生源途径的研究变得非常重要。共附生或内生微生物（真菌、细菌、蓝菌等）是与海洋动植物处于共生、共栖、寄生或附生的关系的微生物。从海洋附生微生物中分离得到许多具有生理活性的化合物。海洋植物和无脊
6、椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的？二、海洋共附生微生物 分离得到的这些四萜化合物是来源于软珊瑚本身，还是由软珊瑚附生微生物产生而在珊瑚体内积累？通过分离和纯化软珊瑚的共附生微生物，并且系统地研究附生微生物的代谢产物，将能揭示这些具抗肿瘤活性的四萜类化合物的真正来源。菌种的筛选 我们课题已经开展了该珊瑚附生微生物的分离工作，已经分离、纯化了30多株真菌和细菌，发现一株真菌（SarcoF5）在GYP培养基中生长良好。(A)培养10天的生长情况 (B)培养20天的生长情况 (C)培养30天的生长情况 (D)培养40天的生长情况图3 SarcoF5生长情况图微生物的培养 以葡萄糖
7、(10g/L)、蛋白胨(3g/L)、酵母膏(1g/L)、100%人工海水(粗海盐23g/L)、pH7.5为培养基（GYP培养基）配制150L培养液分装到若干个1000ml的锥形瓶中，在124高温高压下灭菌1h。接入菌种扭曲肉芝软珊瑚内生真菌SarcoF5，28下静置培养40天。代谢产物的提取 待内生真菌SarcoF5长到40天后，用纱布过滤，培养液用乙酸乙酯提取三次，菌体用甲醇浸泡。合并乙酸乙酯提取液，旋转蒸发至干，浓缩得到棕色提取物43.16g，菌体的甲醇提取物也得到45.2g。培养液提取物的分离培养液乙酸乙酯提取物(43.16g)硅胶柱层析以PE、EA和MO为洗脱剂进行梯度洗脱48个组分薄
8、层层析合并化学成分相似组分，选择几个组分进行细分8-9合并液13-15合并液16-19合并液硅胶柱层析以PE、EA和MO为洗脱剂进行梯度洗脱PE:EA2:1/1:1硅胶柱层析以PE、EA和MO为洗脱剂进行梯度洗脱100%乙酸乙酯用乙酸乙酯和石油醚混合液进行多次重结晶化合物1（sarcoF5-1）化合物2（sarcoF5-2）化合物3（sarcoF5-3）图4 分离流程图实验结果 图5 分离得到化合物结构图OOH3COHOHHOHOH3CCH3H3CHOHH3COH3CH3CCH3OHOOCH3HSarcoF5-1SarcoF5-2(new)SarcoF5-3(new)结构鉴定SarcoF5-1
9、 实验分离出来的SarcoF51（青霉酸）是一种无色针状的晶体，分子式为C8H10O4,相对分子量为170.16。据文献报导它的熔点为83,极易溶于热水、乙醇、乙醚和氯仿,但不溶于戊烷、己烷。345O2OH3C129OHO10HH11167810a10b图6 SarcoF5-1结构图 ppm (f1)0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0 1000 2000 3000 4000 5000图7 SarcoF5-1-1HNMR 345O2OH3C129OHO10HH11167810a10b ppm (f1)0 50 100 150 200-5000 0 5000
10、 10000 15000 20000 25000 30000 35000图8 SarcoF5-1-13CNMR 345O2OH3C129OHO10HH11167810a10b ppm (f1)0 50 100 150 200-100 0 100 200 300 400图9 SarcoF5-1-DEPT-135 345O2OH3C129OHO10HH11167810a10bPositionCDEPTH234589101112172.0286.32171.17109.5857.88133.97114.3617.43CCHCCCH3CCH2CH35.233.935.21(10a)5.5010b)5.
11、931.96表表1 SarcoF51 NMR数据数据(1H NMR 300MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)SarcoF5-1互变反应 SarcoF5-1为青霉酸，是一个很强的多聚乙酰类霉菌毒素，首先由Alsberg等在1912年分离得到。OOOHOHHCOOHOHHO乙醇中重结晶熔融状态下结晶Tautomerism of penicillic acid.Munday,C.W.Nature(London,United Kingdom)(1949),163 443-4.CODEN:NATUAS ISSN:0028-0836.Journal language unav-ail
12、able.CAN 43:31631 AN 1949:31631 CAPLUS the keto acid the lactone 结构鉴定SarcoF5-2图10 SarcoF5-2结构图H3C11658942H3C12CH3OHOOCH3H13710131514 SarcoF5-2为无色透明针状晶体，ESI-MSm/z 213.2(M1)+，分子式为C12H20O3。ppm (f1)0.0 5.0 10.0 0 500 1000图11 SarcoF5-2-1HNMR H3C11658942H3C12CH3OHOOCH3H13710131514 ppm (f1)0 50 100 150 200
13、 0 10000 20000 30000 40000 50000图12 SarcoF5-2-13CNMR H3C11658942H3C12CH3OHOOCH3H13710131514图13 SarcoF5-2-DEPT-135 ppm (f1)0 50 100 150 200 0 500H3C11658942H3C12CH3OHOOCH3H13710131514表表2 SarcoF52 NMR数据数据(1H NMR 300MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)PositionCDEPTH2345689101112131415172.93124.87150.66203.9035
14、.6327.2022.9443.6526.6222.8022.9422.80CCHCCCH2CHCH3CH2CHCH3CH3CH313.1536.60(4a)2.451.890.902.472.090.950.900.95结构鉴定SarcoF5-3图14 SarcoF5-3结构图956O HO1023H3C1213CH3H3CHOHH3CO1478111416159a SarcoF5-3为无色透明树枝状晶体，EI-MSm/z 228.2(M)+，分子式为C12H20O4，不饱和度为3。图15 SarcoF5-3-1HNMR ppm (f1)0.0 5.0 10.0 0 100 200 300
15、400 500956O HO1023H3C1213CH3H3CHOHH3CO1478111416159a ppm (f1)0 50 100 150 200 0 5000图16 SarcoF5-3-13CNMR 956O HO1023H3C1213CH3H3CHOHH3CO1478111416159a ppm (f1)0 50 100-1500-1000-500 0 500 1000 1500 2000图17 SarcoF5-3-DEPT-135 956O HO1023H3C1213CH3H3CHOHH3CO1478111416159a表表3 SarcoF5-3 NMR数据数据(1H NMR 3
16、00MHz，13C NMR 75MHz，CDCl3，TMS)PositionCDEPTH1234568910121314151675.9332.3420.06151.32200.5618.66123.78172.1643.6927.0422.8522.85CHCHCH3CCCH3CHCCH2CHCH3CH39.264.871.951.020.866.24(9a)2.442.110.969.260.96正在开展的研究研究不同培养条件下的代谢产物情况：1.初步在GYP培养基中加入蒽酮，在培养液提取物中发现并分离得到了四萜化合物methyl sartortuoate。在此培养条件下进行200L大规模
17、的培养、提取工作已经完成。系统的分离工作正待开展。SarcoF5-Culture+entong#58RT:1.77AV:1SB:30 0.01-0.90NL:1.07E7T:+c Full ms 60.00-2000.00200400600800100012001400160018002000m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative AbundanceAFSAFF290.3318.3319.4705.5276.3683.31387.4972.1334.3765.3433.21001.1666.1933.1225.2587.3112
18、3.51404.51383.21200.51483.21579.9197.31730.71898.81943.1图18 加入蒽酮后培养液提取物质谱图SarcoF5-Culture+entong#121 RT:3.90 AV:1 NL:2.22E6T:+c Full ms 600.00-2000.0060070080090010001100120013001400150016001700180019002000m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance1388.41387.4683.2705.5972.11000.
19、1765.4665.41389.41382.31448.4766.41137.2958.31123.21138.0647.4843.41449.31033.1879.21153.31220.31309.21479.71703.51615.31551.21855.81745.51898.51981.9OOHCOOCH3HOHOOOHmethyl sartortuoate2.利用甘油代替葡萄糖作为碳源，也培养了200升，提取、分离工作有待后续开展。图19 大规模培养情况图致谢 本论文是在导师李厚金副教授的悉心指导下完成的，感谢李老师这一年来对我的培养和教诲。李老师严谨的科学作风和博学都是值得我一生学习的。感谢张雷师兄、王守亮师兄和李淑清师姐等在实验过程中给予的帮助和支持。本研究课题得到化学与化学工程学院第八届（2007年度）创新化学实验与研究基金项目的资助，在此深表感谢。Thanks！
