1、第二第二节节 结构研究方法结构研究方法天然产物结构研究难度较大：天然产物结构研究难度较大：未知因素太多未知因素太多 样品量少样品量少 结构复杂结构复杂主要借助波谱方法进行综合解析主要借助波谱方法进行综合解析，必要时必要时 结合化学降解，衍生物制备等结合化学降解，衍生物制备等方方法。法。一、化合物的纯度测定一、化合物的纯度测定1.1.检查晶形检查晶形2.2.测定熔点测定熔点3.TLC或或PPC检查：检查：一一般需般需要要三种三种系系统统，且且需需 用通用显色剂显色（如硫酸、用通用显色剂显色（如硫酸、磷磷钼酸钼酸等等）。）。4.GC或或HPLC程序程序方法方法初步判断化合物类型初步判断化合物类型1
2、.1.注意观察样品在提取、分离过程中的行为。注意观察样品在提取、分离过程中的行为。2.2.测定有关理化性质，如不测定有关理化性质，如不同同 pH、不同溶剂中、不同溶剂中的溶解度及层析行为，灼烧试验、化学定性反应等。的溶解度及层析行为，灼烧试验、化学定性反应等。3.结合文献调研结合文献调研1.分子式测定可采用下列某种方法：分子式测定可采用下列某种方法：元素定量分析分子量测定元素定量分析分子量测定测定分子式，计算测定分子式，计算同位素峰同位素峰法法不饱和度不饱和度HR-MS确定分子中含有的官能团确定分子中含有的官能团或结构片断，或基本骨架或结构片断，或基本骨架2.2.计算不饱和度计算不饱和度1.1
3、.官能团定性及定量分析官能团定性及定量分析2.2.测定并解析化合物的有关光谱：测定并解析化合物的有关光谱：如如 UV、IR、MS、1HNMR、13CNMR3.3.结合文献调研结合文献调研综合分析光谱解析及官能团定性，定量分析结综合分析光谱解析及官能团定性，定量分析结果果推断并确定分子的平面结构推断并确定分子的平面结构与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、衍生物制备或人工合成）。衍生物制备或人工合成）。推断并确定分子的立推断并确定分子的立4.进一步确定立体结构进一步确定立体结构测测定定 CD 或或 ORD 谱谱体结构（构型、构象）体结构（构型、构象）
4、测测定定 NOE 或或 2DNMR 谱谱进进行行 X-ray 人工合成人工合成二二结结 构构 研研 究究 的的 主主 要要 程程 序序已知化合物：已知化合物：与标准品对照：与标准品对照：共薄层（三种以上系统）共薄层（三种以上系统）：Rf值相同值相同 共熔点共熔点共红外共红外无标准品：与文献数据对照无标准品：与文献数据对照mp,IR,UV,MS,1H NMR,13CNMR未知化合物未知化合物确定分子式、分子量：确定分子式、分子量：元素分析、质谱元素分析、质谱、1HNMR、13CNMR谱谱功能基、基本骨架和结构式确定：功能基、基本骨架和结构式确定：1、定性反应、定性反应3、化学反应、化学反应2、反
5、应薄层、反应薄层3、波谱法、波谱法三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法（一）确定分子式，计算不饱（一）确定分子式，计算不饱和和度度1.元素定量分元素定量分析析分子分子量量测测定定元素定量分析：元素定量分析：C、H、N，O分子量测定：冰点下降法（固体物质）、沸点上升法分子量测定：冰点下降法（固体物质）、沸点上升法（液体物质）、粘度法、凝胶过滤法，质谱法（液体物质）、粘度法、凝胶过滤法，质谱法（MS）。）。2.同位素峰度同位素峰度比比法法化合物化合物M+,M+1+,M+2+峰峰的强的强度度为定为定值值3.高分辨质谱高分辨质谱（HRMS）法法物质的质量物质的质量精确精确测测定到定
6、到小小数数点点后后第第4位位4.不饱和度的计算：不饱和度的计算：C25H30O15u=25-30/2+0/2+1=11CnHmOvHOHOH OHHOOOHOOH OHOHHOHOHOOHHHHH OHu=IV-I+III+122u=2n+2-m2u=2 25+2-30=112（二）天然产物结构鉴定主要（二）天然产物结构鉴定主要波波谱方法谱方法 红外光谱红外光谱 紫外光谱紫外光谱 质谱质谱 核磁共振谱核磁共振谱 旋光谱及圆二色谱旋光谱及圆二色谱 X-射线衍射射线衍射1.红外光谱（红外光谱（IR,Infra-red Spectrometry）原理：有机分子吸收红外光原理：有机分子吸收红外光（50
7、04000 cm-1）后后 产生化学键振动而形成的吸收产生化学键振动而形成的吸收光光谱。谱。作用：功能基的确定，如羰基作用：功能基的确定，如羰基、双键双键、芳芳环环等等 应用：未知物鉴别、化学结构应用：未知物鉴别、化学结构确确定定 化学反应检查、化学反应检查、区别异构体区别异构体纯度检查、质量控制纯度检查、质量控制 环境污染监测等环境污染监测等NCH3HOOCH2OHOCCH消旋山莨菪碱消旋山莨菪碱OHAromatic ringC=O特征区：特征区：40001250 cm-1确定功能基团确定功能基团3000 cm-1 2900 cm-11900-1650 cm-11690-1600 cm-1特
8、征峰疏，易辨认特征峰疏，易辨认OH、NH2、COOHC-H 伸缩振动伸缩振动 C=O 伸缩振动伸缩振动 C=C 伸缩振动伸缩振动 C-H 弯曲振动弯曲振动烯或芳环取代情况烯或芳环取代情况吸收峰密集，结构微小吸收峰密集，结构微小变变化敏感化敏感1000-650cm-1指纹区：指纹区：1250 400 cm-1区别两个化合物是否相同区别两个化合物是否相同2.紫外光谱紫外光谱（UV,Ultra-Violet Spectrometry）原理：有机分子吸收紫外光（原理：有机分子吸收紫外光（200-500nm）后产）后产 生电子振动而形成的吸收光谱。生电子振动而形成的吸收光谱。应用：主要用于测定分子内的应
9、用：主要用于测定分子内的共共轭系轭系统统。饱和烃：无紫外吸收饱和烃：无紫外吸收 不饱和脂肪烃：不饱和脂肪烃：孤立双孤立双键：键：200 nm共轭双键：共轭双键：200 nm 芳环：取代苯环芳环：取代苯环200 nm黄酮类化合物黄酮类化合物386200300400500268333MeOHMeONaHOCH3异环共轭双烯异环共轭双烯240,250,260 nmHOCH3孤立双键孤立双键205 250 nm 微弱吸收微弱吸收HOCH3同环共轭双烯同环共轭双烯285 nmHOOCH3,-不饱和羰基不饱和羰基242 250 nmOOOMeRha(1-2)GlcOMeOOH3.质谱（质谱（MS,Mass
10、 Spectrometry）原理：样品在质谱仪中生成阳原理：样品在质谱仪中生成阳离离子，子，在在稳稳定定磁场磁场 中按质核比（中按质核比（m/z）顺序进行分离，）顺序进行分离，检检测器测器纪纪录。录。质谱可以给出化合物的准分子质谱可以给出化合物的准分子离离子峰子峰、分分子子离子离子 峰及碎片峰，借此推断化合物峰及碎片峰，借此推断化合物的的结构。结构。用途：确定化合物分子量，用途：确定化合物分子量，糖、苷分子中单糖的连接顺糖、苷分子中单糖的连接顺序序。质谱的种类：质谱的种类：1.EI-MS：电子轰击质：电子轰击质谱谱 Electron impact ionization2.CI-MS：化学电离质
11、化学电离质谱谱 Chemical ionization3.FI-MS：场致电离质：场致电离质谱谱 Field ionization4.FD-MS：场解析电离质场解析电离质谱谱 Field desorption ionization5.FAB-MS：快速原子轰击电快速原子轰击电离离质谱质谱 Fast atom bombardment ionization6.ESI-MS：电喷雾电离质：电喷雾电离质谱谱 Electrospray ionization7.MALDI-MS：基质辅助激光解析基质辅助激光解析电电离质谱离质谱8.API-MS：大气压电离质谱：大气压电离质谱（1）电子轰击质谱）电子轰击质谱
12、（EI-MS）electron impact ionization样品经样品经高温高温（300 C）气化）气化，气气态分态分子子受一受一定定能能 量的电子冲击而电离和裂解产量的电子冲击而电离和裂解产生生各种各种阳阳离离子子。分子离子峰；碎片峰。分子离子峰；碎片峰。应用：苷元、易气化的小分子应用：苷元、易气化的小分子CH2=CH2m/z 28M+（2）场解析质谱（）场解析质谱（FD-MS）原理：样品不经气化与载体表原理：样品不经气化与载体表面面形成形成薄薄膜，膜，在在强电场作用下电离为阳离强电场作用下电离为阳离子子。应用：难挥发，热不稳定的糖应用：难挥发，热不稳定的糖、肽等肽等（3）快原子轰击质
13、谱）快原子轰击质谱（FAB-MS）原理：样品与甘油混合由载体原理：样品与甘油混合由载体引引入，入，分分子子经经快速快速 原子氩轰击后进入质谱仪。原子氩轰击后进入质谱仪。应用：高分子、热不稳定、强应用：高分子、热不稳定、强极极性的性的糖糖、肽肽等等M-rhaM-rha-glcM-rha-rha-glc M-rha-rha苷元苷元M+Na+M-ribM+H+M-rib-rha+M-rib-rha-glc+6-C-糖糖 （glc）M-163 甲基甲基5-C-糖糖（rha）M-147 5-C-糖糖 （ara）M-133FAB-MS：m/z:611M-1+,465(M-147),303(M-147-16
14、3)OHOHOCH3OOHOHHOOHOO HOOHOOOHOHOHOOHOOOHOHOHOHOOCH3OOHHOOHHO 4.电喷雾质电喷雾质谱谱 ESI-MSElectro spray ionization通过电场产生带电液滴，样品离通过电场产生带电液滴，样品离子子通过通过离离子蒸子蒸 发后进行分析。发后进行分析。电离过程几乎不产生碎片，适电离过程几乎不产生碎片，适合合混合混合物物分分析析；多肽、蛋白等可有多个质子化多肽、蛋白等可有多个质子化点点，特，特别别适适合合；受溶剂、酸度、杂质等因素影受溶剂、酸度、杂质等因素影响响很大很大，尽尽可可能用甲能用甲 醇为溶剂；醇为溶剂；质谱图中多出质谱
15、图中多出现现M+Na+、M+K+、M+NH4+、M+Cl-峰，可据此判断准分子离峰，可据此判断准分子离子子峰；峰；必要时建议同时进行正、负离必要时建议同时进行正、负离子子扫描。扫描。ESI-TOF+-MSESI-TOF-MSM+H+M+Na+M-H+分子量：分子量：452根据样品结构确定检查手段：根据样品结构确定检查手段：小分子，易挥发化合小分子，易挥发化合物物-GC-MS；小分子，热稳定化合小分子，热稳定化合物物-EI；m/z 8 邻位偶合以及同碳偶合邻位偶合以及同碳偶合邻位偶合常邻位偶合常数数二面角二面角同碳偶合同碳偶合 远程偶合远程偶合4.NOE效应（效应（nuclear overhau
16、ser effect）NOE差谱：普通差谱：普通1H谱与照射谱与照射特特定质定质子子所所得得的谱的谱相相减减，只保留被增强的峰。只保留被增强的峰。空间距空间距离离 0.4 nm（二）核磁共振碳谱（二）核磁共振碳谱（13C-NMR）13C信号的裂分：符信号的裂分：符合合n+1规律规律q（CH3）、t（CH2）、d（CH）、）、s（-C-）。全去偶谱全去偶谱1.化学位化学位移移 0210 碳原子杂化碳原子杂化：sp3 sp sp2 碳核周围电子云密度：密碳核周围电子云密度：密度度，诱导效应：电负诱导效应：电负性性，共轭效应共轭效应 空间效应空间效应 重原子效应重原子效应 分子内氢键分子内氢键 取代
17、基数目取代基数目 介质效应介质效应 温度效应温度效应（三）二维核磁共振（三）二维核磁共振（2D-NMR）1H-1H COSY HMQC（HSQC）HMBC NOESY TOCSY对角线峰对角线峰对称交叉峰对称交叉峰1.1H-1H COSY（COrrelation SpectroscopY）同一自旋偶合体系里质子之间的同一自旋偶合体系里质子之间的偶偶合相合相关关。2.HMQC：异核多量：异核多量子子相干相干谱谱 （heteronuclear multiple quantum coherence）直接键连的直接键连的C-H间的偶合相关。间的偶合相关。3.HMBC：异核多键相干谱：异核多键相干谱（H
18、eteronuclear Multiple Bond Connectivity）提供两键或大于两键，主要是提供两键或大于两键，主要是三三键键的的C-H偶合信偶合信 息，抑制了直接偶合信息息，抑制了直接偶合信息（1JCH），建立，建立C-C间的间的 关联，甚至越过氧、氮或其他关联，甚至越过氧、氮或其他原原子的子的官官能能团团间的关间的关 联，特别解决由于屏蔽效应难联，特别解决由于屏蔽效应难以以解释解释的的季季碳碳归属问归属问 题。题。4.TOCSY接力相干转移接力相干转移（TOtal Correlation SpectroscopY）一个自旋体系中所有自旋都是相互偶合的一个自旋体系中所有自旋都是
19、相互偶合的，TOCSY谱谱 中交叉峰来自接力相干转移。中交叉峰来自接力相干转移。只要从一个偶合链中选择一个分辨良好、不与其他质只要从一个偶合链中选择一个分辨良好、不与其他质 子信号重叠的信号开始，就可以解析该偶合链中的所有质子信号重叠的信号开始，就可以解析该偶合链中的所有质子信号。子信号。一维一维TOCSY，Homonuclear Hartmann-Hann 二维二维TOCSY甾体皂苷的甾体皂苷的2D-TOCSY谱谱EDBACOOHOOHOHOH OHOHOCH3OOHOOOHO OO OHOOOHOH OHFOH OHOH OOOHHOCH3OOOHOOEOHOHOODFOHOHO OOHO
20、HOHBO OOH OHOHCH3甾体皂苷的甾体皂苷的1D-TOCSY谱谱5.NOESY(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)ROESY(Rotating-frame Overhauser EffectSpectroscopy)旋转坐标系下旋转坐标系下的的NOE实验实验ROESY适用于所有化合物适用于所有化合物NOESY适用于生物大分适用于生物大分子子，小，小分分子不子不适适用。用。空空间距间距离离 0.45 nm有时会出现有时会出现COSY信号信号COSYCOSYCOSY GNOESY：two-dimensional nuclear Overhaus
21、ereffect correlation spectroscopy,二维核欧沃豪斯二维核欧沃豪斯 效应谱效应谱OESY spectrumGlc-13-OMe7-OMeH-2H-4H-5H-8OOHOCH3OH3COOON OHOrhaOHCH2OHH 2H 4H 5H 8H 1OOHO2458五、五、旋旋光谱与圆二色谱光谱与圆二色谱平面偏振光分解为两个周期和振平面偏振光分解为两个周期和振幅幅相同相同，方向方向 相反（左、右）的圆偏振光。相反（左、右）的圆偏振光。平面偏振光在手性环境中传播特性：平面偏振光在手性环境中传播特性：圆双折射性圆双折射性-左旋、右旋圆偏振光左旋、右旋圆偏振光的的折射率折
22、射率不同。不同。两种两种 圆偏振光传播速度不同圆偏振光传播速度不同，平面偏振光角度旋转平面偏振光角度旋转 比旋光度比旋光度-使用单一波长光源（钠使用单一波长光源（钠光光D）；）；旋光光谱旋光光谱-使用连续波长光源使用连续波长光源 圆二色圆二色性性-左旋、右旋圆偏振左旋、右旋圆偏振光光吸收系吸收系数数不同，导致圆偏不同，导致圆偏振光振幅发生改变，形成椭圆偏振光。振光振幅发生改变，形成椭圆偏振光。圆二色谱圆二色谱-吸收系数差吸收系数差=L-R，化合物生色团附近摩化合物生色团附近摩 尔椭圆度尔椭圆度=3300 1.比旋光度（比旋光度（specific optical rotatory）2.C8H17
23、OH5-胆甾烷胆甾烷-3酮酮（4）C8H17OOH谱线与谱线与5相似相似H5-胆甾烷胆甾烷-3酮酮（5）OH3.圆二色谱解析方法圆二色谱解析方法 经验规则：八区律、螺旋规则经验规则：八区律、螺旋规则、扇形扇形规规则则 半经验方法：激发态手征性半经验方法：激发态手征性 量化计算量化计算：ORD、ECD、VCD计算计算1.八区律规则八区律规则（1）饱和环酮）饱和环酮OOHHOO106H12Oneo-克罗烷二萜6.单单晶晶X射线衍射（射线衍射（X-ray diffraction method）X射线为短波长电磁波。射线为短波长电磁波。当当X射线射线照照射射在在被被测测样品上时，因光的干涉作用而样品上
24、时，因光的干涉作用而产产生衍生衍射射效效应应。单晶体是指样品中所含分子（原单晶体是指样品中所含分子（原子子或离或离子子）在三维空间中呈规则、周期排在三维空间中呈规则、周期排列列的一的一种种固固体体状态状态。纯度较高的化学成分在合适。纯度较高的化学成分在合适的的溶剂溶剂系系统统中中经重经重 结晶可得到适结晶可得到适合合X射线衍射射线衍射使使用的用的单单晶晶样样品，品，其其 大小约大小约为为0.5mm左右。左右。X射线射线 照射照射单晶单晶 样品样品衍射衍射 信息信息计算机计算机 数据处理数据处理分子中分子中 原子排列原子排列分子晶胞堆积图分子晶胞堆积图分子立体结构投影图分子立体结构投影图单晶单晶
25、X射线衍射特点：射线衍射特点：1 1只需一颗单晶只需一颗单晶体体(约约1/4-1/6mg)，微量成分结构鉴定；微量成分结构鉴定；2 2对药物中共晶样品可给出准确、定量的分析结果；对药物中共晶样品可给出准确、定量的分析结果；3 3可获得药物分子的绝对构型（全新骨架）；可获得药物分子的绝对构型（全新骨架）；4 4可以准确地计算出被测化合物的构象信息：可以准确地计算出被测化合物的构象信息：分子骨架各环的船或椅式构分子骨架各环的船或椅式构象象、环、环与与环间环间的的顺反联顺反联接接方式、方式、环自身的平面性质、环与环环自身的平面性质、环与环间间的扭的扭转转角、角、侧链的相对取向位置、大环侧链的相对取向
26、位置、大环构构象等。象等。5 5可以准确地计算出药物分子的氢键、盐键、配位键可以准确地计算出药物分子的氢键、盐键、配位键 的成的成键方式和数值。键方式和数值。6 6可以确定天然药物中水溶性大分子（蛋白质、多肽可以确定天然药物中水溶性大分子（蛋白质、多肽、多糖类等）的准确三维结构，结晶猪胰岛素。、多糖类等）的准确三维结构，结晶猪胰岛素。利用单晶利用单晶X射线衍射测定分子绝对构型方法：射线衍射测定分子绝对构型方法：1 1含重原子的分子，利用分子中所含重原子含重原子的分子，利用分子中所含重原子的的X射线反射线反常散射常散射(色散色散)效应，准确测定分子构型。效应，准确测定分子构型。2 2不含重原子的
27、分子（只不含重原子的分子（只含含C、H、O、N原子），使用原子），使用CuK 或或MoK 辐射辐射 直接法：测量反常散射点对的衍射数据，如青蒿素。直接法：测量反常散射点对的衍射数据，如青蒿素。间接法：利用结构中已知构型的基团或引入另一个已知间接法：利用结构中已知构型的基团或引入另一个已知 绝对构型的手性分子。如重结晶中，引入手性试剂（绝对构型的手性分子。如重结晶中，引入手性试剂（如如D或或 L-酒石酸等）形成共晶的单晶体，以手性试剂的已知构型酒石酸等）形成共晶的单晶体，以手性试剂的已知构型 为参照，得到待测分子的绝对构型。为参照，得到待测分子的绝对构型。CH3 NOH OHOCH3*OHO经经
28、1D和和2D NMR数据分析确定数据分析确定rohitukine平面平面结结构构，哌啶环上有两个手性中心。，哌啶环上有两个手性中心。HOCH3OHOO OON CH3BrHOCH3OHOO OHN CH3RS参考书目：参考书目：1.1.再帕再帕尔尔阿不力孜阿不力孜.天然产物研究方法和技天然产物研究方法和技术术.化化 学工业出版社学工业出版社，20102.Robert M.Silverstein et al.药明康德译药明康德译.有机化有机化 合物的波谱解合物的波谱解析析.华东理工大华东理工大学学出版出版社社，20093.3.吴立军著吴立军著.实用有机化合物实用有机化合物光光谱解谱解析析.人人民民卫卫生生 出版社出版社，20094.4.姚新生等，有机化合物波谱解姚新生等，有机化合物波谱解析析，中，中国国医医药药科科 技出版社技出版社，1997思思考题考题：1、化、化合物结构合物结构鉴鉴定的一定的一般般程序程序。2、根根据电据电离离的方的方法法不同不同，质谱质谱包包括哪括哪些些技术？技术？其电其电离离原理原理、特点特点、适用适用于于哪类哪类成成分的分的测测定？定？3、核、核磁磁共振共振技技术包术包括括哪些哪些？这些这些技技术的术的主要主要 用途？用途？
