1、第八章第八章 分离纯化的组合应用分离纯化的组合应用江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院第三篇第三篇 分离技术的融合与集成分离技术的融合与集成第八第八章章 分离纯化的组合应用分离纯化的组合应用概述概述分离的主要流程分离的主要流程分离技术的选择和组合分离技术的选择和组合典型生物分子分离实例分析典型生物分子分离实例分析一一 概述概述观点：为了成功地分离样品，必须根据样品特性和分离目的合理地设计出分离纯化实验方案。由于每个分离任务涉及的目标分子，样品中杂质成分，需达到的分离效果都是不同的，因此不存在通用的分离纯化方案。生化分离过程往往是将若干单元纯化技术联合使用而实现的。选择合理单元纯化技术固然很
2、重要，然而如何将这些技术合理的组合和按顺序使用也是成功的分离所必须考虑的。初始阶段中间阶段精制纯度分离步骤分离纯化的三个不同阶段分离纯化的三个不同阶段初始阶段初始阶段主要任务在于从相对较大体积的抽提液中去除大量杂质，同时能浓缩样品和保障样品处稳定的环境条件。此时所选择的方法往往希能满足快速大规模处理的需要，此阶段选择方法的时候侧重点应放在速度和处理量上。一般匀浆和沉淀技术、膜过滤技术等可以在此阶段的前期使用，此阶段的后期则可以使用离子交换和亲和层析等技术。中间阶段中间阶段主要任务在于进一步除去大量杂质，如混在目的蛋白质中的其他蛋白质、核酸和多糖等，而这些杂质与目的物的性质差异相对较小，显然选择
3、的分离方法要有较高的分辨率，作为中间过程要处理的样品量仍比较大，所以此阶段选择分离方法的侧重点应放在分辨率和处理量上。离子交换、亲和层析、制备级等电聚焦等技术可以在此阶段使用。精制阶段精制阶段主要任务在于最后除去微量杂质，使最后的产品获得高纯度，最后的微量杂质往往与目的物的性质较为接近，所以此阶段分离方法的侧重点主要放在分辨率上。尽管分离技术仍然可以采用离子交换、凝胶层析等技术，但可通过选择高效的填料来满足高分辨率的要求。各种技术的使用频率各种技术的使用频率二二 分离的主要流程分离的主要流程建立分析方法生化分离整个过程一旦开展，都应首先建立快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度），以保证
4、分离工作顺利进行。三种三种分析分析鉴定鉴定方法类型方法类型1、生物测定方法一个生物测定方法的建立，必须选择适当的生物对象，继而决定测试的生物反应类型，如加入受试物后细菌的生长或抑制，血压的变化，组织分泌物的增加或减少等。然后在定性反应基础上进一步建立生物反应的定量标准。2、理化测定方法是一种最常用最方便的分析测定方法，主要根据目的物的初步了解的特殊的理化性质建立定性定量的鉴定方法，这类方法常有：比色法、层析法、光谱法、电泳法等。理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离过程，判断分离方法的实际效果。3、理化方法与生物学方法结合测定对于某些生物体内含量较低，或所建立的理化测定方法的
5、特异性和灵敏度不足以反映该物质定性与定量的要求时，常常需要结合生物学方法来全面准确地反映该物质的存在情况。分析鉴定方法分析鉴定方法的的要求要求一个好的分析鉴定方法必须满足以下要求：特异性或专一性强；重现性好；准确度高；灵敏度高；时间短，操作简便。提取材料选择提取材料选择选择材料的范围：包括动物、植物、微生物选材的主要原则：来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少三三 分离分离方法方法的的选择选择1、目的物是胞内物质还是胞外物质2、原料中产物和主要杂质浓度3、产物和主要杂质的物理化学特性差异4、产品的用途和质量标准5、产品的市场价格6、废物的处理方法影响下游技术工艺选择的因素：生物分离过程的一般流程
6、生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离(离心、过滤离心、过滤)细胞胞内产物细胞胞内产物路线路线1 1路线路线2 2细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线路线1A1A路线路线1B1B清液胞外产物清液胞外产物粗分离（沉淀、膜过滤等粗分离（沉淀、膜过滤等)纯化纯化(层析、电泳层析、电泳)脱盐脱盐(凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤)浓缩浓缩(超滤、蒸发超滤、蒸发)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性四四 典型生物分子分离实例分析典型生物分子分离实例分析蛋白质（酶）的分离纯化与鉴定 核酸的分离纯化与鉴定 多糖的分离纯化与鉴定 小分子物质的分离
7、与鉴定 蛋白质（酶）的分离纯化与鉴定蛋白质（酶）的分离纯化与鉴定 蛋白质（酶）分离纯化的原则 温和、高效、低成本 蛋白质（酶）纯度的鉴定 1.层析法 (常用RP-HPLC)2.凝胶电泳(常用SDS-PAGA)3.超离心法(需带分析系统的超离心设备）4.N端序列测定（均一单链蛋白，N端残基仅一种）5.溶解度测定（适合已知种类蛋白质）实例1 一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及鉴定 工艺路线：枯草芽孢杆菌发酵粗酶液乙醇分级沉淀（37.5%60%）得酶沉淀，缓冲液溶解，15000rpm冷冻离心10min，去除沉淀SephadexG-75凝胶过滤Phenyl-sepharose 6FF疏水层析SDS-PAG
8、E鉴定纯度在不确定氨肽酶分子量的基础上，先采用中等分离范围的SephadexG-75（分级范围300080000）进行分离。乙醇分级后酶液经过SephadexG-75凝胶过滤，层析柱（1.1cm60cm），pH8.5，50mmol/LTris-HCl缓冲液（含0.1mmol/L的Co2）平衡柱子，上样量0.5mL，缓冲液流速为0.4mL/min，每管收集1.2mL，LNA法检测酶活。Sephadex G-75凝胶过滤图谱凝胶过滤图谱 有两个蛋白质峰，只有峰有酶活性，SDS-PAGE显示有三条主带，回收率为70.3，纯化倍数21.6。SephadexG-75凝胶过滤凝胶过滤层析柱（1.5cm40
9、cm），以含0.8mol/L的(NH4)2SO4的pH8.5，25mmol/LTris-HCl缓冲液平衡柱子，上样量2.5mL后，分别以含0.8mol/L，0.6mol/L，0.4mol/L，0.2mol/L(NH4)2SO4的 pH8.5，25mmol/LTris-HCl缓冲液进行阶段洗脱，280nm检测出峰，以LNA法检测酶活。Phenyl Sepharose 6FF疏水层析疏水层析Phenyl Sepharose 6FF疏水层析图谱疏水层析图谱盐浓度0.8mol/L时，一部分未吸附的蛋白洗脱下来，0.6mol/L时没有出峰，0.4mol/L、0.2mol/L盐浓度均有洗脱峰，测定酶活，只
10、有峰具有活性。回收率为12.6，纯化倍数100.7SDS-PAGE鉴定氨肽酶纯度鉴定氨肽酶纯度1.分子量标准分子量标准,2.乙醇分级沉淀乙醇分级沉淀,3.Sephadex G-75,4.Phenyl Sepharose 6FF疏水层析疏水层析 SDS-PAGE比较和鉴定各步氨肽酶分离纯度比较和鉴定各步氨肽酶分离纯度提纯步骤提纯步骤总酶活（总酶活（U）总蛋白（总蛋白（mg）比活（比活（U/mg）回收率（）回收率（）纯化倍数纯化倍数粗酶液（粗酶液（500mL）39350025.45154601001乙醇分级沉淀乙醇分级沉淀3431004.397815087.25.1Sephadex G-75276
11、6000.828433390070.321.6Phenyl-sepharose6FF495810.0319155670012.6100.7氨肽酶纯化结果工艺路线：银杏种仁破碎缓冲液4浸取离心得上清液硫酸铵分级沉淀（30%80%）DEAE-52离子交换层析MonoQ离子交换层析SDS-PAGE鉴定纯度。实例2 银杏种仁中一种抗氧化活性蛋白的纯化及鉴定 DEAE-52离子交换层析离子交换层析将经硫酸铵分级沉淀后的粗蛋白提取液透析后用磷酸缓冲液调pH6.5，上样，层析柱(2.0cm15cm)，起始缓冲液为pH6.5，0.02mol/L的磷酸缓冲液。洗脱缓冲液为含0.1mol/L，0.2mol/L，0
12、.3mol/L，0.4mol/L的NaCl，pH6.5的磷酸缓冲液，阶段洗脱，流速1ml/min。在280nm波长下检测，收集峰液，以DPPH法检测抗氧化活性。经检测B2的抗氧化活性较高，且蛋白含量也较高。银杏银杏种仁蛋白的种仁蛋白的DEAE-52离子交换层析离子交换层析 Mono Q离子交换层析离子交换层析将有活性的B2部分浓缩脱盐，用磷酸缓冲液调整pH为7.0，上MonoQ离子交换层析柱(1.0cm10cm)，起始缓冲液为pH7.0，0.02mol/L的磷酸缓冲液。线性梯度洗脱，缓冲液为pH7.0，0.02mol/L的磷酸缓冲液，NaCl的浓度在30min内由0.01mol/L增加到0.4
13、mol/L，流速1ml/min，在280nm波长下检测，收集峰液，适当浓缩后以DPPH法检测，峰C1的抗氧化性较高，收集峰C1。银杏银杏种仁蛋白的种仁蛋白的MonoQ离子交换层析离子交换层析 SDS-PAGE鉴定纯度鉴定纯度SDS-PAGE鉴定蛋白质亚基也为单一条带，分子量为8.7KD工艺路线：薏苡种子经破碎反复浸提等预处理硫酸铵分级盐析（50%75%）层析聚焦离子交换层析SDS-PAGE实例3 利用层析聚焦和离子交换层析快速分离分析薏苡38ku抗真菌蛋白聚焦聚焦层析（层析聚焦）层析（层析聚焦）补充知识点：聚焦层析是依据蛋白质的等电点差异和离子交换行为不同，聚焦层析是依据蛋白质的等电点差异和离
14、子交换行为不同，在在等电聚焦等电聚焦的基础上发展起来的，这一方法既有的基础上发展起来的，这一方法既有聚焦聚焦作用，作用，同时又有高分辨率的优点。同时又有高分辨率的优点。利用离子交换技术载样量高的特点，它可以把样品集中在利用离子交换技术载样量高的特点，它可以把样品集中在0.040.05个个pH梯度内，一次层析可以纯化几百毫克蛋白。梯度内，一次层析可以纯化几百毫克蛋白。一、流动相和固定相一、流动相和固定相流动相为多缓冲剂：由一系列精选的物质构成，在一定的流动相为多缓冲剂：由一系列精选的物质构成，在一定的pH范围具有相似的较强的缓冲能力。范围具有相似的较强的缓冲能力。Polybuffer 96和和P
15、olybuffer 74，如果将它们混合则在，如果将它们混合则在49范围都有较强缓冲能力。范围都有较强缓冲能力。固定相为多缓冲交换剂，通过化学方法把固定相为多缓冲交换剂，通过化学方法把带有多种电荷基团带有多种电荷基团的配体的配体与其偶联而成。由于这种多缓冲交换剂存在多种类型电与其偶联而成。由于这种多缓冲交换剂存在多种类型电荷基团，所以它的缓冲能力也相当强，可以自发的形成荷基团，所以它的缓冲能力也相当强，可以自发的形成pH梯梯度，同时也是离子交换的活性集团。度，同时也是离子交换的活性集团。基本原理基本原理在离子交换层析中，在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。梯度溶液的形成是
16、靠梯度混合仪实现的。pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成离子交换层析离子交换层析而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂上而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂上带有具有缓冲能力的电荷基团，故带有具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。梯度溶液可以自动形成。聚焦层析聚焦层析9876蛋白质的行为蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI）和层析柱中的）和层析柱中的pH值。当值。当柱中的柱中的pH低于蛋白质的低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，
17、固定相中的换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其高于其pI时，蛋白质时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于再次低于pI时，它又带正电荷，时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到复进行，于是各种蛋
18、白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。了分离的目的。pH梯度下移的速度是梯度下移的速度是poly buffer流速的流速的1/10，流出时是它的，流出时是它的等电点。等电点。不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。pH值是沿着柱长增加的，在此值是沿着柱长增加的，在此pH梯度中，梯度中，蛋白质的蛋白质的pIpH时，其带正电荷，从离子时，其带正电荷，从离子交换剂上解吸出来，交换剂上解吸出来，pI=pH时
19、不移动。时不移动。67pH89Protein 2移动速率移动速率Protein 1聚焦效应聚焦效应蛋白质按其等电点在蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是梯度的形成是聚焦效应的先决条件。聚焦效应的先决条件。4567pH在聚焦层析过程中，一种样品分次加入在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的聚焦时间，就还可以将样品再加到定的聚焦时间，就还可以将样品再加到柱上，其聚焦过程仍能够顺利完成，得柱上，其聚焦过程仍能够顺利完成，得到满意的结果。到满意的结果。聚焦效
20、果聚焦效果分离效果分离效果 聚焦层析聚焦层析Mono P柱，起始缓冲液为 0.075 molL-1Tris，用1 M CH3COOH调pH 9.3；洗脱缓冲液为 poly buffer 96稀释10倍，1 M CH3COOH 调pH6.0，高盐离子洗脱缓冲液为2 M CH3COONa。试验前将各溶液过滤(0.22 m 滤膜)，脱气 5 min。设定流速 0.5 mLmin-1，检测波长280 nm。系统pH计在线监测流动相pH值,每次运行前用 pH 标准液(pH 7.0、pH 10.0)校正。洗脱过程中形成线性pH 下降梯度,梯度(9.0 6.0)内按 0.2 pH 间隔自动收集。当流出液的
21、pH 稳定在 6.0 0.1,注入1 mL高盐离子洗脱缓冲液进行高盐洗脱。薏苡薏苡抗真蛋白的层析聚焦分离图谱抗真蛋白的层析聚焦分离图谱 离子交换层析离子交换层析薏苡抗真菌蛋白的离子交换层析分离图谱薏苡抗真菌蛋白的离子交换层析分离图谱Hitrap SP 柱,Mono S柱，流动相A是25 mmolL-1乙酸，pH 5.0；流动相B是在流动相A中加入NaCl至1 molL-1。洗脱梯度 0%100%NaCl，洗脱体积10个柱体积，流速1 mLmin-1；分离出活性组分用流动相A稀释后第一次Mono S分离，洗脱梯度 0%77%NaCl，洗脱体积15个柱体积,流速 0.8 mLmin-1；分离出的活
22、性组分用流动相A稀释后，再次进行 MonoS分离，洗脱梯度12%24%NaCl，洗脱体积15个柱体积，流速0.8 mLmin-1。实例5 鹰嘴豆分离蛋白分离纯化以RP-HPLC为纯度检测手段，运用Sephacryl S-200和DEAE-Sepharose CL-6B对鹰嘴豆分离蛋白进行分离纯化，得到分子量为170 kD和110 kD的两个主要组分。Sephacryl S-200凝胶层析凝胶层析Sephacryl S-200平衡脱气并装入16mm1.5m柱中。洗脱缓冲液：pH7.6的磷酸盐缓冲液，含0.0325mol/L K2HPO4、0.0026mol/LKH2PO4、0.4mol/L Na
23、Cl、离子强度0.5mol/L 和0.01mol/L巯基乙醇。样品：0.5gCPI溶于10ml pH7.6的磷酸盐缓冲液中，4、10000g离心15min，取上清液，上样量4ml，洗脱流速为16.5ml/h。蛋白质标准分子量蛋白质标准分子量:A-二磷酸果糖酶（二磷酸果糖酶（Mw158000;B-牛血清蛋白（牛血清蛋白（Mw68000）;C-白蛋白（白蛋白（Mw45000）;D-胰凝乳蛋白酶原（胰凝乳蛋白酶原（Mw25000）;E-细胞色素细胞色素C（Mw125000）Sephacryl S-200凝胶分离层析图谱凝胶分离层析图谱 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析离子交换层析
24、DEAE-Sepharose CL-6B层析用起始磷酸盐缓冲液平衡柱子(2.6cm20cm)后上样，洗脱流速为100ml/h。起始缓冲液：pH7.6的磷酸盐缓冲液，含0.0325mol/L K2HPO4、0.0026mol/L KH2PO4。洗脱缓冲液：起始缓冲液中加入不同浓度的NaCl溶液阶段洗脱，NaCl浓度00.5mol/L(如图7.20)，每个阶段浓度洗脱两个柱体积(200ml)。样品制备：S-200分离纯化后得到的组分，在DEAE起始缓冲液中透析脱盐、10kDa超滤膜浓缩后上样。上样量为40ml，蛋白质120mg。S-200峰峰2 S-200峰峰3DEAE-Sepharose-6B分
25、离纯化图谱分离纯化图谱（3）RP-HPLC检测检测据蛋白质的表面疏水性差异，利用反相层析柱对DEAE分离纯化得到的组分B、D进行纯度鉴定，结果可看出，B和D在C18柱上的保留时间分别为9.696min 和9.439min，但同时都有一个裂解峰，保留时间分别为9.432min和9.081min(除此之外均为溶剂峰)。C18 RP-HPLC纯度鉴定图谱纯度鉴定图谱小结：上述5个分离实例中，前期都须根据材料的不同特点进行一定的前处理，中后期往往是将两种技术组合起来，有疏水层析+凝胶层析、离子交换+离子交换、层析聚焦+离子交换、凝胶过滤+离子交换，并通过SDS-PAGE或Nature-PAGE或RP-
26、HPLC进行纯度鉴定，纯化效果得到了相对标准化的评价。二、核酸的分离纯化与鉴定二、核酸的分离纯化与鉴定核酸的分离纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域，核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。核酸核酸分离纯化的原则分离纯化的原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。为保证核酸的完整性，在操作过程中，应尽
27、量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，如过酸或过碱，对磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，须采用适宜的缓冲液，始终控制pH在410之间；如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在04的条件下进行。对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。如DNA酶的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，就可抑制DNA酶的活性。分离技术路线的设计分离技术路线的设计大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核
28、酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。实例6 一种核酸疫苗的纯化将过夜发酵的含质粒pVAXGAG的细菌培养液经碱裂解法制备出裂解液，经粗提后去除菌体蛋白后作为样品进入纯化阶段。（类似于质粒的提取）用层析技术中的凝胶过滤、亲和、离子交换层析3种方法，依次对一种核酸疫苗进行纯化，并检测其纯度。核酸疫苗（nucleic acid vaccine）,也称基因疫苗（genetic vaccine），是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA 或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达
29、到预防和治疗疾病的目的。补充：Sepharose 6FF纯化核酸疫苗纯化核酸疫苗凝胶过滤层析柱用0.15mol/LNaOH处理2h除热原，注射用水充分洗去NaOH后，再用缓冲液A充分平衡至电导、紫外吸收、盐浓度、pH值均稳定。通过上样泵，以10ml/min的流速上样，上样量为0.13个柱床体积(CV)，约为120ml。上样后用缓冲液A洗脱，流速10ml/min。按照260nm紫外吸收曲线及洗脱体积分峰收集，第1个峰即为收集峰。Sepharose 6FF 柱纯化核酸疫苗柱纯化核酸疫苗 Plasmid select亲和层析柱纯化核酸疫苗亲和层析柱纯化核酸疫苗亲和层析柱先用0.15mol/LNaOH
30、处理2h去除热原，用注射用水充分洗去NaOH后，再用60ml缓冲液A以5ml/min的流速平衡，此时的电导、紫外吸收、盐浓度、pH值均稳定。使用上样泵将Sepharose6FF凝胶过滤层析柱获得的DNA以4ml/min的流速上样。上样结束后用缓冲液A洗脱2个CV约60ml，再用缓冲液B洗脱5个CV约150ml，流速均为4ml/min。按照260nm紫外吸收曲线及洗脱体积收集第2个峰，获得超螺旋DNA。Plasmidselect 亲和层析亲和层析柱纯化核酸疫苗柱纯化核酸疫苗Plasmidselect亲和层析柱中的填料能与超螺旋 DNA非特异地结合,再通过盐浓度的改变进行洗 SOURCE30Q离子
31、交换层析柱去除内毒素离子交换层析柱去除内毒素离子交换层析柱先用0.15mol/LNaOH处理2h去除热原,用注射用水充分洗去NaOH后，再用2个CV约60ml缓冲液 C平衡，流速5ml/min。根据所获得超螺旋DNA的体积，用注射用水进行4倍稀释，以5ml/min的流速上样。用缓冲液C洗脱2个CV约60ml,再用缓冲液D洗脱5个CV约150 ml。按照260nm紫外吸收曲线收集出峰SOURCE 30Q离子交换层析柱纯化核酸疫苗离子交换层析柱纯化核酸疫苗 琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸疫苗纯度琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸疫苗纯度琼脂糖凝胶电泳分析以200ng/孔的DNA量进行琼脂糖凝胶电泳，可见经凝胶过滤层析
32、后已未见RNA，超螺旋的DNA含量明显高于解环的DNA1-DNA粗提样品；粗提样品；2-Sepharose 6FF纯化后；纯化后；3-Plasmidselect纯化后；纯化后；4-SOURCE 30Q纯化后纯化后琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸疫苗纯度鉴定核酸疫苗纯度结果表明：连续使用3种层析方法获得的DNA达到了理想的分离效果，琼脂糖凝胶电泳未检出 RNA，A260与A280的比值介于11802100之间，其中环状DNA达90%以上。经离子交换层析后的内毒素含量小于10EU/mgDNA，宿主DNA残留量小于0.002g/g DNA。三、多糖的分离纯化与鉴定三、多糖的分离纯化与鉴定多糖（p
33、olysaccharide）是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质利用多糖溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，通常采用热水浸提后用酒精沉淀的方法，对多糖进行粗提去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等柱层析在多糖的纯化较为常用，应用较多的有两类：一是分子筛作用的凝胶过滤层析，适用于不同分子量组分的多糖分离；二是离子交换层析，适合于分离各种酸性，中性多糖和粘多糖实例7：一种真菌酸性蛋白聚糖的纯化首先通过热水抽提、过滤、有机溶剂沉淀、透析和冻干等一系列过程得到粗多糖，然后用阴离子交换层析和凝胶过滤层析结合使用纯化其中的酸性组分。将
34、粗多糖溶解后加样至填充了DEAE-纤维素的离子交换柱（345cm），洗去不吸附组分后，用02mol/L的NaCl线性梯度进行洗脱，流速为1ml/min，检测到活性峰的峰值出现在NaCl浓度达到0.43mol/L时（图A）。收集得到的活性分部在蒸馏水中透析并浓缩，然后加样至填充了Sepharose CL-4B凝胶柱（1.5105cm），用pH6.4，0.01mol/L的磷酸钠缓冲液进行洗脱，流速为1ml/min，洗脱曲线见图B，图中同时显示了作为分子量标准的兰葡聚糖-2000（MW2,000,000），葡聚糖-5251（MW473,000）和葡聚糖-1662（MW41,272）的洗脱位置，在得到
35、纯化样品的同时测出该蛋白聚糖的分子量为150,000。左：左：DEAE-纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析,横坐标为分部收集时的分部号横坐标为分部收集时的分部号,纵坐标纵坐标O.D.值经值经DNS显色后测出显色后测出;右：对右：对离子交换后的活性分部进行离子交换后的活性分部进行Sepharose CL-4B凝胶过滤层析凝胶过滤层析,O.D.值经值经DNS显色后测出显色后测出。从从Phellinus linteus的子实体中提取的粗多糖中纯化酸性蛋白聚糖的子实体中提取的粗多糖中纯化酸性蛋白聚糖A AB B四、小四、小分子物质的分离与分子物质的分离与鉴定鉴定实例9：广西五步蛇毒小肽的分离纯化经S
36、ephadexG-75凝胶过滤、超滤和DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析法从广西五步蛇毒中分离纯化获得一种小分子的肽类 SephadexG-75凝胶过滤凝胶过滤取2.0g蛇毒溶于10mL的碳酸氢铵缓冲液(0.02mol/L)中，4000r/min离心30min，取上清。用此缓冲溶液平衡好的SephadexG-75柱(2.6100cm)进行分离。收集活性峰,并进行超滤，去除相对分子质量大于10000的物质五步蛇五步蛇粗毒的粗毒的sephadexG-75层析图谱层析图谱 DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析离子交换层析组分溶于0.01mol/L醋酸铵(pH8.5)缓冲
37、溶液中，在已经用相同的缓冲溶液平衡好的DEAE-SepharoseCL-6B柱(2.6100cm)中用0.05(pH8.5)、0.5(pH7.5)、1.0mol/L(pH6.0)的醋酸铵缓冲溶液进行梯度洗脱。收集第四和第五峰之间组分冻干备用。DEAE-SepharoseCL-6B层析图谱层析图谱 高效高效液相和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析液相和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SDS-PAGE鉴定蛇毒肽纯度3、4-为纯化组分在还原和非还原条件下高效液相鉴定纯度基本达层析纯和电泳纯，相对分子量为7800专利案例介绍抗体的分离纯化抗体（Antibody），又称免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称 Ig），
38、是一种由B细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。讨论：抗体的分离方法总结Ana C.A.Roque,Cludia S.O.Silva,M.ngela Taipa.Affinity-based methodologies and ligands for antibody purification:Advances and perspectives.Journal of Chromatography A,1160(2007)4455Klaus Huse,Hans-Joachim Bhme,Gerhar
39、d H.Scholz.Purification of antibodies byaffinity chromatography.J.Biochem.Biophys.Methods 51(2002)217231关于抗体分离纯化的两篇综述：单克隆抗体药物的工业纯化单克隆抗体药物的工业纯化实例10：单克隆抗体的纯化单克隆抗体(MAb)人源化的有点：减少降低了机体的免疫排斥反应 募集效应因子或效应细胞 在体内的半衰期长 对于该现象的解释是：人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管内皮细胞上的Fc受体（FcRn)，使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解，并能够回到血液中参与循环。鼠抗体由于不能有效的与人FcR
40、n结合而很快从循环系统中清除。n将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体瘤技术，产生大量完全人源化抗体靶点肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-)人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HE2)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGF)CD20程序
41、性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白配体1(programmed death 1/programmed death ligand 1，PD-1/PD-L1)血小板衍生生长因子/血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor/platelet derived growth factorreceptor，PDGF/PDGF)枯草溶菌素转换酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)等等部分药物数据2015年，市场规模年，市场规模72亿，占全球亿，占全球1.19%，外资企业产品占，外资企业产品占80%预计
42、预计2020年，仅销售前五的抗体药物就高达年，仅销售前五的抗体药物就高达430亿美金亿美金抗体药物：已上市抗体药物：已上市90个（一说个（一说63个），临床到上市阶段共约个），临床到上市阶段共约721个，近个，近85%处于处于不同临床阶段不同临床阶段中国全球已上市单抗中，全球已上市单抗中，12个在国内获批上市个在国内获批上市多家药企进军抗体药物，但以仿制为主多家药企进军抗体药物，但以仿制为主纯化涉及的理化性质Fc与链霉菌、金葡菌等表面的Protein A具有特异性亲和性Fc杂环氨基酸较多，具有一定的疏水性单抗一般为弱碱性，pI约为9与单抗一起的杂蛋白或杂质:血清白蛋白，细胞内蛋白，细胞膜蛋白，
43、IgG二聚体，细胞，核酸，病毒，细菌，细胞培养液离心过滤Protein A亲和层析深层过滤阴离子交换层析阳离子交换层析除病毒过滤超滤浓缩和缓冲液置换加入辅料溶液稀释超滤置换后浓缩液-7010避光贮存冷冻干燥工艺流程实例病毒灭活除菌过滤生物药品生物药品离心过滤目标体系分析：目标体系分析：细胞、胞外单抗溶液，培养液残余原理、作用和原理、作用和目的：目的：利用离心和深层过滤器进行微滤，去除宿主细胞（主要以动物细胞为主），使料液澄清，便于后面的层析过程。关键设备：关键设备：连续流离心机、深层过滤器夹具、深层过滤膜ProteinA亲和层析n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，培养液残余，杂蛋白，核酸，
44、病毒，细菌等n原理、作用和目的：原理、作用和目的：利用Protein A对IgG的亲和作用进行亲和吸附，达到初步捕获和纯化的作用n关键设备：关键设备：层析系统、层析柱、层析介质病毒灭活n目标体系分析：目标体系分析：单抗洗脱液溶液n原理、作用和目的：原理、作用和目的：利用洗脱后较低的pH进行孵放约120min灭活病毒，然后回复pH到5.2左右。n关键设备：关键设备：密封容器深层过滤n目标体系分析：目标体系分析：灭活病毒后的单抗溶液n原理、作用和目的：原理、作用和目的：利用深层过滤器进行微滤，去除灭活过程出现的杂质（病毒和蛋白聚集体等），使料液澄清，便于后面的层析过程。n关键设备：关键设备：深层过
45、滤器夹具、深层过滤膜阴离子交换层析n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，含混合杂质n原理、作用和目的：原理、作用和目的：离子交换法，吸附酸性蛋白、核酸，甚至部分细菌、病毒、以及泄露Protein A，IgG随溶液流穿，达到进一步纯化的目的n关键设备：关键设备：层析系统、层析柱、层析介质阳离子交换层析n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，较纯，含二聚体等杂质n原理、作用和目的：原理、作用和目的：离子交换法，吸附和分离IgG、二聚体和杂蛋白，要求阳离子交换介质具有较高的吸附容量和分辨率，达到纯化IgG的目的n关键设备：关键设备：层析系统、层析柱、层析介质除病毒过滤n目标体系分析：目标体系分析：
46、单抗溶液，高纯，少量病毒等n原理、作用和目的：原理、作用和目的：利用深层过滤器进行微滤，去除病毒n关键设备：关键设备：深层过滤器夹具、过滤病毒用膜超滤浓缩和缓冲液置换n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，高纯，含高盐n原理、作用和目的：原理、作用和目的：脱盐、浓缩、置换缓冲液，为制剂做准备n关键设备：关键设备：超滤设备、超滤膜包加入辅料溶液稀释超滤置换后浓缩液n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，高纯n原理、作用和目的：原理、作用和目的：为制剂做准备，（药用级山梨醇、聚山梨酯20）n关键设备：关键设备：容器除菌过滤n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，高纯，辅料n原理、作用和目的：原理、
47、作用和目的：利用除菌过滤器进行微滤，去除细菌n关键设备：关键设备：微滤设备，微滤膜，无菌封管机-7010避光贮存n目标体系分析：目标体系分析：单抗溶液，高纯，辅料n原理、作用和目的：原理、作用和目的：冷冻保存或为冻干做准备n关键设备：关键设备：冷冻冰箱冷冻干燥n目标体系分析：目标体系分析：单抗冷冻液n原理、作用和目的：原理、作用和目的：准备冻干粉n关键设备：关键设备：冷冻干燥机小结本工艺：protein A亲和Q阴离子交换SP阳离子交换；单抗的其他工业纯化方法：1、protein A亲和HCIC（疏水电荷诱导）Q阴离子交换2、protein A亲和HIC（疏水层析）Q阴离子交换实例11 重组胰
48、岛素的分离纯化胰岛素的工业纯化胰岛素的工业纯化胰岛素(insulin)p定义定义：胰岛素：胰岛素：是由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。重组人胰岛素重组人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。（现阶段临床最常使用的胰岛素）功能和作用胰岛素的功能 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。胰岛素的研究历史 1921年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年-重结晶胰岛素19
49、30s-传统中、长效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素1982年-采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市90年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。生产企业国内申报胰岛素的有十几家，真正生产的4-5家。通化东宝、联邦制药主要生产重组人胰岛素，甘李药业专做第三代胰岛素，东阳光可生产第二代和第三代胰岛素。诺和诺德（最先推出长效胰岛素，预混胰岛素，高纯胰岛素，人体胰岛素和胰岛素注射笔）、礼来（速效）以及赛诺菲安万特（长效）外资企业。宿主：通化东宝、万邦生化和甘李药业都是大肠杆菌发酵表达，珠海联邦和东阳光采用毕赤酵母表达系统。结
50、构 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。聚体聚体胰岛素二聚体（胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（胰岛素六聚体（hexamer）改进型胰岛素结构与人胰岛素类似，仅局部（多数为B链）氨基酸类型微小差异甘精胰岛素（长效）Detemir（地特胰岛素，丹麦诺和诺德公司，超长效）赖脯胰岛素（速效）天门冬胰岛素（速效）结构与人胰岛素类似，仅局部
