1、免疫荧光技术在免疫荧光技术在某些皮肤病中某些皮肤病中 的的 应应 用用主讲人：周桂芝主讲人：周桂芝概 述 抗原与相应的抗体接触后，立即结抗原与相应的抗体接触后，立即结合而形成不易分离的抗原抗体复合物。合而形成不易分离的抗原抗体复合物。在结合之前，先使抗体（或抗原）与某在结合之前，先使抗体（或抗原）与某些显色剂偶联，则形成的抗原抗体复合些显色剂偶联，则形成的抗原抗体复合物由不可见成为可见，从而可以确定组物由不可见成为可见，从而可以确定组织中是否存在某种抗原（或抗体），这织中是否存在某种抗原（或抗体），这就是免疫病理技术的基本原理。根据抗就是免疫病理技术的基本原理。根据抗体（或抗原）标记物的不同分
2、为免疫荧体（或抗原）标记物的不同分为免疫荧光技术和免疫酶标技术。光技术和免疫酶标技术。免疫荧光技术的发展免疫荧光技术的发展 1941年年 由由Coons首先建立了免疫荧光技术首先建立了免疫荧光技术 1961年年 由由Kaskin首先将该技术应用到皮肤科首先将该技术应用到皮肤科 1963年年 Burnham等报告了红斑狼疮病人表皮、等报告了红斑狼疮病人表皮、真皮间基底膜真皮间基底膜IgG、C3沉积沉积 1964年年 Beutner和和Jordon利用免疫荧光技术研利用免疫荧光技术研究天疱疮究天疱疮 1967年年 区分出大疱性类天疱疮区分出大疱性类天疱疮 70年代开始应用免疫电镜去认识大疱性皮肤病
3、年代开始应用免疫电镜去认识大疱性皮肤病 近来，皮肤病理工作者应近来，皮肤病理工作者应用免疫荧光技术对大疱性皮肤用免疫荧光技术对大疱性皮肤病、红斑狼疮、扁平苔癣、银病、红斑狼疮、扁平苔癣、银屑病、皮肤血管炎等免疫病理屑病、皮肤血管炎等免疫病理特征进行了研究，并已广泛应特征进行了研究，并已广泛应用于常规病理诊断、鉴别诊断用于常规病理诊断、鉴别诊断及指导治疗。及指导治疗。缺点：缺点：（1）标记的荧光极易褪色，不能长久保）标记的荧光极易褪色，不能长久保存。存。（2）影响荧光强度的因素很多，而且判）影响荧光强度的因素很多，而且判断阳性荧光与非特异性荧光有一定的主断阳性荧光与非特异性荧光有一定的主观性。观
4、性。（3）阳性荧光细胞无法与常规石腊切片）阳性荧光细胞无法与常规石腊切片对照观察，组织学定位困难。对照观察，组织学定位困难。（4）需要较好的冰冻切片机和荧光显微）需要较好的冰冻切片机和荧光显微镜等，因此它的应用受到一定的限制。镜等，因此它的应用受到一定的限制。免疫荧光技术（一）（一）原理：原理：将荧光色素（异硫氰酸荧光素）将荧光色素（异硫氰酸荧光素）与特异性抗体以化学的方法结合起与特异性抗体以化学的方法结合起来，即为荧光抗体，再用这种荧光来，即为荧光抗体，再用这种荧光抗体作为一种试剂，在特定的条件抗体作为一种试剂，在特定的条件下浸染标本，与标本中相应的抗原下浸染标本，与标本中相应的抗原结合。在
5、组织中形成含有荧光标记结合。在组织中形成含有荧光标记的抗体的抗体抗原复合物，再用荧光显抗原复合物，再用荧光显微镜观察标本。微镜观察标本。（二）方法：（二）方法：1、直接法（、直接法（DIF）：用荧光素标记的特：用荧光素标记的特异性抗体来检查未知抗原。如组织中存有相异性抗体来检查未知抗原。如组织中存有相应的抗原，便结合，形成复合物。应的抗原，便结合，形成复合物。抗原抗原 标记抗体标记抗体 玻片玻片 标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物 优点：优点：（1）方法简单，需时短。）方法简单，需时短。（2）特异性强。）特异性强。缺点：缺点：（1）不能用已知抗原检查未知抗体。）不能用已知抗原检查未知抗体。（
6、2）为了检查各种抗原，需要准备多种）为了检查各种抗原，需要准备多种特异性荧光抗体。特异性荧光抗体。（3）敏感性较差。）敏感性较差。2、间接法（、间接法（IIF）：用荧光标记的抗体来：用荧光标记的抗体来检查未知抗原或未知抗体。检查未知抗原或未知抗体。抗原抗原 抗原抗体抗原抗体 复合物复合物 未标记抗体未标记抗体 玻片玻片 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 标记抗体标记抗体 双抗体复合物双抗体复合物 优点：优点：（1）既能检查未知抗原，也能检查未知抗体。）既能检查未知抗原，也能检查未知抗体。（2）用一种标记抗体，能检查多种抗体复合物。）用一种标记抗体，能检查多种抗体复合物。（3）敏感性高。）敏感性高。
7、缺点：缺点：（1）由于参加的因素多，受干扰的机会也多，）由于参加的因素多，受干扰的机会也多，故结果有时判断困难。故结果有时判断困难。（2）方法较麻烦，时间较长。）方法较麻烦，时间较长。3、补体荧光抗体法、补体荧光抗体法：用荧光素标记的抗补：用荧光素标记的抗补体抗体检测未知抗原或未知抗体。体抗体检测未知抗原或未知抗体。抗原抗原+抗体抗体 +补体补体 复合物复合物 抗原抗原 抗体抗体 补体补体 抗原抗原+抗体抗体+补体复合物补体复合物 抗补体标记抗体抗补体标记抗体 荧光标记补体复合物荧光标记补体复合物优点：优点：具有间接法的一些优点。具有间接法的一些优点。缺点：缺点：非特异性荧光更多。非特异性荧光
8、更多。在皮肤病中的应用 免疫荧光检查，对某些皮免疫荧光检查，对某些皮肤病已成为一种极重要的临床肤病已成为一种极重要的临床和组织学检查的补充方法，既和组织学检查的补充方法，既能检查血清，又能检查活体标能检查血清，又能检查活体标本。本。（一）标本（一）标本 1、血清标本、血清标本：取血：取血2ml，不加，不加抗凝剂，室温下放置片刻，凝抗凝剂，室温下放置片刻，凝固固 离心离心 分离出血清分离出血清 冷冷冻保存。冻保存。2、皮肤活检标本、皮肤活检标本：进行皮肤：进行皮肤活检时，其所取标本部位的选活检时，其所取标本部位的选择十分重要，直接关系到免疫择十分重要，直接关系到免疫病理的结果如何。病理的结果如何
9、。皮肤病免疫荧光皮肤病免疫荧光疾疾 病病活活 检检 部部 位位沉沉 积积 部部 位位天疱疮天疱疮皮损周围正常皮肤皮损周围正常皮肤 表皮细胞间表皮细胞间IgG、C3副肿瘤天副肿瘤天疱疮疱疮皮损周围皮肤皮损周围皮肤表皮细胞间表皮细胞间IgG、基、基底膜线状底膜线状C3、IgGIgA天疱疮天疱疮 损害周围皮肤损害周围皮肤表皮细胞间表皮细胞间IgA大疱性类大疱性类天疱疮天疱疮红斑损害周围皮肤红斑损害周围皮肤 基底膜线状基底膜线状C3、IgG瘢痕性类瘢痕性类天疱疮天疱疮损害周围皮肤损害周围皮肤基底膜线状基底膜线状C3、IgGEBA损害周围皮肤损害周围皮肤基底膜线状基底膜线状C3、IgG疾疾 病病活活 检
10、检 部部 位位沉沉 积积 部部 位位线状线状IgA大大疱性皮肤病疱性皮肤病损害周围皮损害周围皮肤肤基底膜线状基底膜线状IgA、IgG疱疹样皮炎疱疹样皮炎损害附近正损害附近正常表现皮肤常表现皮肤真皮乳头真皮乳头IgA、C3妊娠疱疹妊娠疱疹损害周围皮损害周围皮肤肤基底膜线状基底膜线状C3、偶、偶IgG扁平苔癣类扁平苔癣类天疱疮天疱疮大疱周围皮大疱周围皮肤和扁平苔肤和扁平苔藓样损害藓样损害基底膜线状基底膜线状IgG、C3IgG、IgM、IgA、C3胶样小体胶样小体疾疾 病病活检部位活检部位沉沉 积积 部部 位位红斑狼红斑狼疮疮皮损和正常皮损和正常皮肤（皮肤（SLE）表皮、真皮连接处颗粒状表皮、真皮连
11、接处颗粒状IgG、IgM、IgASCLE皮损皮损表皮颗粒状表皮颗粒状IgG大疱性大疱性红斑狼红斑狼疮疮损害周围皮损害周围皮肤肤基底膜线状基底膜线状IgG、IgA（50%病病历），表皮、真皮连接处颗粒历），表皮、真皮连接处颗粒状状IgG、IgM、IgA、C3（50%病历）病历）皮肌炎皮肌炎皮损皮损表皮、真皮连接处灶性表皮、真皮连接处灶性IgG、IgM、胶样小体；皮肤和肌肉血、胶样小体；皮肤和肌肉血管周围管周围IgM硬皮病硬皮病皮损皮损通常为阴性，表皮细胞核通常为阴性，表皮细胞核IgG，偶然偶然（二）皮肤病 1、红斑狼疮、红斑狼疮：在目前红斑狼疮的诊：在目前红斑狼疮的诊断和研究中，直接免疫荧光（断
12、和研究中，直接免疫荧光（DIF）已成）已成为一种重要的手段。为一种重要的手段。（1）狼疮带试验（）狼疮带试验（LBT）：用直接免：用直接免疫荧光法来确定疫荧光法来确定DLE皮损，皮损，SLE皮损及正皮损及正常皮肤的表皮、真皮交界处免疫球蛋白和常皮肤的表皮、真皮交界处免疫球蛋白和补体的沉积。一般沉积抗体是以补体的沉积。一般沉积抗体是以IgM、IgG、C3为主为主，IgA少，呈线状或带状或少，呈线状或带状或颗粒状。有时真皮内血管壁上可有颗粒状。有时真皮内血管壁上可有IgG、IgM沉积。沉积。（2）LBT诊断价值：诊断价值：LBT是诊断是诊断LE的重要检测方法，的重要检测方法，具很高的特异性，具很高
13、的特异性，SLE皮损部位皮损部位LBT阳阳性率为性率为90%，未受累皮肤为，未受累皮肤为54%，DLE皮损处为皮损处为90%。如果。如果LBT（+）可以确诊）可以确诊LE，因此能将临床上与，因此能将临床上与LE相似的其他皮相似的其他皮肤病鉴别。但是肤病鉴别。但是LBT（-）也不能排除）也不能排除LE，因因LE患者的患者的LBT不是百分之百的阳性。不是百分之百的阳性。LBT可用于可用于SLE与与DLE的鉴别诊断。的鉴别诊断。对无皮损的对无皮损的SLE，LBT有助于诊断。有助于诊断。LBT对对SLE与其他抗核抗体阳性疾病与其他抗核抗体阳性疾病作鉴别时，具有参考价值。作鉴别时，具有参考价值。狼疮带假
14、阳性。狼疮带假阳性。狼疮带对治疗敏感，经大约狼疮带对治疗敏感，经大约6个个月治疗后，月治疗后，LBT可转变为阴性，可转变为阴性，（血内抗体阴转可很快，但皮损内（血内抗体阴转可很快，但皮损内抗体消失慢），抗体消失慢），SLE病情加重病情加重LBT由由阴性转为阳性。（阴性转为阳性。（Ig沉积在基底细胞沉积在基底细胞的半桥粒、基底板内及真皮内的纤的半桥粒、基底板内及真皮内的纤维成份中）维成份中）2、天疱疮、天疱疮：DIF 患者几乎百分之百均可查到表患者几乎百分之百均可查到表皮细胞间抗体，呈鱼网状沉积，主要皮细胞间抗体，呈鱼网状沉积，主要为为IgG，约，约3050%病人可病人可有有IgM、IgA。未治
15、疗的病人伴未治疗的病人伴C3。红斑型天疱疮除了。红斑型天疱疮除了在表皮出现细胞在表皮出现细胞间间IgG抗体外，抗体外，23-80%的病人伴有基底膜抗体沉积。的病人伴有基底膜抗体沉积。IIF 查病人血清，约查病人血清，约8090%天疱天疱疮病人有循环的抗表皮细胞间抗体，主要疮病人有循环的抗表皮细胞间抗体，主要是是IgG。病人血清中抗细胞间抗体的滴度。病人血清中抗细胞间抗体的滴度与病情的活动性有密切关系。抗体滴度与病情的活动性有密切关系。抗体滴度1:201:40为低滴度，为低滴度，1:801:160为中等为中等滴度，滴度，1:320以上为高滴度。应每以上为高滴度。应每2-3周做周做一次一次IIF，
16、直至病情减轻，以后每，直至病情减轻，以后每36个个月复查一次。月复查一次。IgA天疱疮：天疱疮：为表皮内嗜中性细胞增多，临床为表皮内嗜中性细胞增多，临床表现为角层下脓疱病样皮肤病和疱疹表现为角层下脓疱病样皮肤病和疱疹样天疱疮，免疫病理为表皮细胞间样天疱疮，免疫病理为表皮细胞间IgA沉积，少数病人沉积，少数病人伴伴IgG、C3沉积。仅沉积。仅为细胞间为细胞间IgA沉积或主要为沉积或主要为IgA，那么，那么IgA天疱疮诊断成立。天疱疮诊断成立。50%的病人有循的病人有循环环IgA抗体结合在表皮细胞间，但滴度抗体结合在表皮细胞间，但滴度低低。副肿瘤型天疱疮：副肿瘤型天疱疮：伴恶性疾病特征，常伴肿瘤为
17、非何杰伴恶性疾病特征，常伴肿瘤为非何杰金氏淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病、肠腺金氏淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病、肠腺瘤等，皮损为多形性瘙痒性丘疹、鳞屑，瘤等，皮损为多形性瘙痒性丘疹、鳞屑，水疱，有时似多形红斑，组织学为表皮基水疱，有时似多形红斑，组织学为表皮基底层上棘层松懈，角质形成细胞坏死，角底层上棘层松懈，角质形成细胞坏死，角化不良，表现为天疱疮和多形红斑的特征，化不良，表现为天疱疮和多形红斑的特征，DIF 细胞间细胞间IgG+，伴有或不伴有，伴有或不伴有C3沉积，沉积，同时基底膜有同时基底膜有C3或或IgG沉积沉积。IIF 有抗表有抗表皮细胞间抗体和抗基底膜抗体。皮细胞间抗体和抗基底膜抗体。3
18、、大疱性类天疱疮大疱性类天疱疮（BP）DIF 在皮损周围的皮肤基底膜有线在皮损周围的皮肤基底膜有线状状IgG（95%），），C3（100%）沉积，阳）沉积，阳性率为性率为95%-100%。少数病人可有。少数病人可有IgM沉沉积。（沉积在透明板和基底细胞下方）积。（沉积在透明板和基底细胞下方）IIF 约约7080%病人血清中病人血清中有有IgG抗抗基底膜循环抗体。抗体滴度与病情活动性基底膜循环抗体。抗体滴度与病情活动性之间似无明显关系。之间似无明显关系。4、疱疹样皮炎（疱疹样皮炎（DH）DIF 非受损皮肤真皮乳头部有颗粒状非受损皮肤真皮乳头部有颗粒状IgA沉积。阳性率为沉积。阳性率为95%，抗体
19、沉积最常，抗体沉积最常见为颗粒型，而连续线型少见。个别病人见为颗粒型，而连续线型少见。个别病人除除IgA沉积外还伴有沉积外还伴有C3沉积。（颗粒状沉积。（颗粒状IgA沉积在真皮乳头弹力纤维原纤维）沉积在真皮乳头弹力纤维原纤维）IIF 循环抗基底膜抗体阴性。抗平循环抗基底膜抗体阴性。抗平滑肌肌内膜滑肌肌内膜IgA循环抗体阳性（循环抗体阳性（80%）。）。5、线状线状IgA大疱性皮病（大疱性皮病（LABD）DIF IgA在基底膜呈线状沉积，阳在基底膜呈线状沉积，阳性率性率100%，1/3病人可有病人可有IgM、C3沉沉积。积。IIF 约约733%病人血清中有循环病人血清中有循环抗体抗体IgA，抗原
20、为，抗原为97KD（沉积在致密（沉积在致密板的两侧，即透明层和致密板下区板的两侧，即透明层和致密板下区）6、妊娠疱疹（妊娠疱疹（HG）为在妊娠期出现的特殊类型的大为在妊娠期出现的特殊类型的大疱性类天疱疮。疱性类天疱疮。DIF 基底膜基底膜C3线状沉积，阳性率线状沉积，阳性率100%，约，约3050%病人也可伴有基底病人也可伴有基底膜膜IgG线状沉积。（沉积在透明层）线状沉积。（沉积在透明层）IIF 未查到循环抗体未查到循环抗体。7、获得性大疱性表皮松懈症（、获得性大疱性表皮松懈症（EBA）DIF 基底膜基底膜IgG、C3沉积沉积,阳性阳性率率100%,少数伴少数伴IgA、IgM沉积沉积(沉积沉
21、积在透明层在透明层)IIF 循环抗基底循环抗基底膜膜IgG抗体阳性抗体阳性率率2560%。(沉积在基底板下沉积在基底板下)SiteImmunoreactant DiagnosisICSIgGPV,PF,PNPICSIgAIgA,pemphigusBMZC3,IgGBP,CP,HGBMZIgG,IgA,IgM,C3EBA,bullous LE,CPBMZIgA,C3LADDermis IgA,C3DH几种大疱性皮肤病的鉴别诊断1、BP与与EBA鉴别：鉴别：（1）临床特征临床特征（2）免疫电镜和免疫印迹）免疫电镜和免疫印迹 （3）盐分离皮肤法：）盐分离皮肤法：盐分离正常盐分离正常皮肤作底物，皮肤作
22、底物，IIF，EBA抗体与真皮抗体与真皮侧起反应，侧起反应，BP抗体与表皮侧起反应。抗体与表皮侧起反应。盐分离损害周围皮肤，盐分离损害周围皮肤，DIF2、BP与与HG鉴别：鉴别：BP，70%IIF可查到可查到IgG抗基底膜抗基底膜循环抗体，而大多数循环抗体，而大多数HG病人查不到循病人查不到循环抗体，环抗体，HG病人血清含补体结合的循病人血清含补体结合的循环抗环抗BMZ抗体（又称抗体（又称HG因子），用因子），用IIF很难检出。很难检出。3、线状、线状IgA大疱性皮肤病大疱性皮肤病与与DH鉴别鉴别：线状线状IgA大疱性皮肤病，大疱性皮肤病，DIF检查检查基底膜处基底膜处IgA线状沉积，循环抗体
23、线状沉积，循环抗体为为IgA，而，而DH是真皮乳头颗粒状是真皮乳头颗粒状IgA沉沉积。积。大疱性皮肤病抗体沉积部位超微结构图 图图1、正常表正常表皮基底皮基底膜超微膜超微结构结构图图2、表皮基底膜显示自身表皮基底膜显示自身抗体结合部位的超微结构抗体结合部位的超微结构图图3、大疱性皮肤病自身抗体沉积大疱性皮肤病自身抗体沉积部位及抗原分子量部位及抗原分子量图图4、寻常型天疱疮寻常型天疱疮(DIF)图图5、寻常型天疱疮(IIF)图图6 6、IgAIgA天疱疮天疱疮(DIF)(DIF)图图7、大疱性类天疱疮大疱性类天疱疮(DIF)IgG(DIF)IgG沉积沉积图图8、大疱性类天疱疮大疱性类天疱疮(DI
24、F)C3(DIF)C3沉积沉积图图9、线线状状IgAIgA大疱性皮肤病大疱性皮肤病(DIF)(DIF)IgA IgA沉积沉积图图10、获得性大疱性表皮松懈症获得性大疱性表皮松懈症盐分离正常皮肤盐分离正常皮肤(IIF)IgG(IIF)IgG沉积在真皮侧沉积在真皮侧图图11、大疱性类天疱疮盐分离正常大疱性类天疱疮盐分离正常皮肤皮肤(IIF)IgG(IIF)IgG沉积在表皮侧沉积在表皮侧 图图12、红斑狼疮红斑狼疮(DIF)IgM(DIF)IgM带状沉积带状沉积少见大疱性皮肤病例介绍 例例1患者患者 女女 43岁，干部岁，干部 口腔溃疡，疼痛口腔溃疡，疼痛3个月。个月。口腔双侧颊粘膜后侧及舌左口腔双
25、侧颊粘膜后侧及舌左侧缘表浅溃疡，左侧颊粘膜溃疡侧缘表浅溃疡，左侧颊粘膜溃疡约约0.50.3cm，未见水疱。，未见水疱。图图13图图14图图15例2 患者患者 男男 21岁岁 农民农民主诉主诉：全身反复起水疱：全身反复起水疱3年，复发加重年，复发加重1个月个月现病史现病史：3年前双足起水疱，易破溃，年前双足起水疱，易破溃，3天后泛发全身，天后泛发全身，用激素治疗后消退，但停药后复发，反复治疗达用激素治疗后消退，但停药后复发，反复治疗达2年余，年余，至至5个月前停药，又复发，收入院治疗。个月前停药，又复发，收入院治疗。皮肤科检查皮肤科检查：四肢躯干广泛密集分布豆大丘疹，水疱，：四肢躯干广泛密集分布
26、豆大丘疹，水疱，疱壁紧张，尼氏征（疱壁紧张，尼氏征（-），头皮散在淡红色斑块，躯干散），头皮散在淡红色斑块，躯干散在大小不一淡白色斑片，口腔粘膜（在大小不一淡白色斑片，口腔粘膜（-）。）。病理检查病理检查：表皮下水疱，疱底真皮浅层散在嗜酸性粒细：表皮下水疱，疱底真皮浅层散在嗜酸性粒细胞。胶原纤维水肿，血管扩张。胞。胶原纤维水肿，血管扩张。DIF 表皮基底膜表皮基底膜IgG、C3强阳性沉积，强阳性沉积，IgM、IgA弱阳性。弱阳性。图图16图图17图图18 图19图图20图图21图图22参参 考考 文文 献献1、Inter J Dermatol 1993;32(3):153-1612、Dermatologic cinic 1994;12(1):133-1423、Dermatologic cinic 1993;11(3):399-4184、J of Cutan Pathol 1994;21(3):200-2065、J Am Acad Dermatol 1992;27(1):79-87 光光 临临
