1、1生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定2生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定三个关键问题三个关键问题:v目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序）目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序）v避免目标蛋白分子的技术性降解（避免目标蛋白分子的技术性降解（-70-70 C C条件下保存，实验操条件下保存，实验操作通常在冰浴下进行，与此同时要作通常在冰浴下进行，与此同时要加全蛋白酶抑制剂）加全蛋白酶抑制剂）v结合实验目的，选择合适的分析方法（定性与定量，相对定结合实验目的，选择合适的分析方法（定性与定量，相对定量与绝对定量）量与绝对定量）3生
2、物系统中总蛋白质的定量q凯式（Kjedahl）定氮法q光吸收法q双缩脲法q福林-酚法q考马氏亮兰G-250法q氨基酸分析法qBCA法4凯式（Kjedahl）定氮法最早的经典方法。各种蛋白质的含氮量相对恒定，1416。计算公式：蛋白质量=含氮量/16%=6.25含氮量。实验步骤如下：注意事项:本法非常灵敏，务必避免外界氨的干扰。一定量蛋白质硫酸铵溶液氨气蛋白质含氮量蛋白质含量(NH4)3BO3浓硫酸浓硫酸NaOH蒸馏蒸馏H3BO3HCl,滴定滴定指示剂指示剂5光吸收法光吸收法因为芳香族氨基酸Tryptophan和Tyrosine的存在，使得Proteins溶液在280nm呈现特征性吸收峰。以此来
3、定量溶液中的Proteins。一个经验公式：当Proteins溶液A280=1时，溶液中Proteins的浓度=1mg/ml。各种Protein所含芳香族Amino acid的含量是不同的，有时会有较大差异，因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。有时Proteins样品中有Nucleic acids存在，Nucleic acids也有紫外吸收，因此会对Proteins的测定产生干扰。这时采取分别测定280nm和260nm光吸收值，并以下式计算。蛋白质浓度（mg/ml）1.45A2800.74A260。6光吸收法光吸收法(continue)最准确的办法是，首先得到Target Protein
4、在280nm的吸光系数，其次针对性地测定该Target Protein溶液的280nm吸光度值，最后再利用公式计算溶液中Target Protein的浓度（C=A280/L,L：比色杯内径cm）。测定Target Protein在280nm的吸光系数，必须首先得到干燥的该Target Protein纯品。在105C下恒重后，精确称量110mg，再定量溶于一定体积的蒸馏水中，通常浓度为1mg/ml，测定溶液280nm光吸收，计算得到吸光系数。7双缩脲法双缩脲法q基于蛋白质链肽键“CONH”有双缩脲反应特性即，Proteins在碱性溶液中与Cu2发生络合反应显蓝色。q受Proteins特异性影响较
5、小。q适用于较大量Proteins（mg）的定量测定。q实验操作简便。8福林-酚法q灵敏度和准确度均较高。q实验操作较繁琐。q影响因素较多，如去垢剂等。9考马氏亮兰考马氏亮兰G-250G-250法法q实验操作简便。q适合于定量10100g 的Proteins。q应用广泛。q测定Proteins的考马氏亮兰G-250溶液也叫作“home-made”试剂。10氨基酸分析法氨基酸分析法q通过把Proteins水解成Amino acid，然后再对Amino acid进行分析来定量Proteins。q很准确，最接近于真实值。q测定值比实际量有时会偏低。主要原因是Protein水解时，Trp被完全破坏，C
6、ys也要遭受很大损失，Ser和Thr的回收也只有90。一种新的测定蛋白质的方法：BCA法11BCA法法q一种新的测定Proteins的方法q灵敏度和重复性均佳。q干扰因素少。q试剂公司（Pierce）有试剂盒供应。12生物系统中某种Target Protein的定量qELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Array）qWestern blottingqEnzyme activity 测定13夹心法（夹心法（sandwich method）AntigenAntibody-1Antibody-2ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Arr
7、ay）14讨论题一：讨论题一：某实验室欲建立一种双抗体夹心法，以检测人血清中蛋白A的含量。以往该实验室曾自己制备了一兔抗人蛋白A多克隆抗体，并从某公司购买了一鼠抗人蛋白A单克隆抗体。该实验室按如下方案进行预实验，结果失败了。请分析最可能的原因是。Antigen，人蛋白，人蛋白APolyclonal antibodymonoclonal Antibody15讨论题二：讨论题二：上述实验室不甘心失败，仔细分析后找到了失败的原因。为了达到实验目的，他们调整实验方案如下，进行预实验，结果又失败了。请分析最可能的原因是。Antigen，人蛋白，人蛋白APolyclonal antibodyMonoclo
8、nal Antibody16讨论题三：讨论题三：.。讨论题讨论题X：.。17MMP-9MMP-2M 1 2 3 4kD2121701167653600 500 400 300 200 100 542.625.01 2 3 4300 250 200 150 100 50 251.43.80.0100.0MMP-9相对密度单位1 2 3 4100.00.0MMP-2相对密度单位M.蛋白marker1.培养液空白对照，2.食管癌细胞SHEEC对照3.有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC4.反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC 细胞培养上清液中MMP-9MMP-9和和MMP-2MMP-2活性的检测结果活性的检测结果18Target Protein的鉴定的鉴定qProtein测序：1）N-end测序，2）C-end测序，3）质谱测序。qpI测定qHPLC分析。qSDS-PAGE电泳分析。qCE分析。q肽谱分析（Fingerprinting）。qMALDI-TOF-MS。19Target Protein的鉴定的鉴定q巯基的鉴定。q糖基修饰的鉴定。q磷酸基修饰的鉴定。q甲基修饰的鉴定。q酰基修饰的鉴定。q酰胺基的鉴定。qX-ray衍射分析Target Protein晶体结构。
