1、激发光谱与荧光光谱n掌握分子荧光产生的过程及其影响因素掌握分子荧光产生的过程及其影响因素n熟悉荧光光度计的基本构件及操作程序熟悉荧光光度计的基本构件及操作程序n了解荧光分析法的特点与应用了解荧光分析法的特点与应用【实验目的】【实验目的】【实验原理】【实验原理】一、分子荧光产生过程一、分子荧光产生过程二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收
2、特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、电子激发三重态 T1、T2 ；一、分子荧光的产生过程一、分子荧光的产生过程2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)；平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三重态能级比相应，三重态能级比相应单重态能级低；单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态
3、处于单重态；S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的几；进入的几率小；率小；VRASnICVRFPTmISC1ICV RV RS0S1T1（S S0 0：单线基态；：单线基态；S S1 1：最低激发单线态；：最低激发单线态；T T1 1：最低激发三线态；：最低激发三线态；A A：吸收；吸收；F F：荧光；荧光；P P：磷光；：磷光；v v：振动驰豫；：振动驰豫；ISCISC：系间窜跃）：系间窜跃）荧光、磷光光物理过程示意图荧光、磷光光物理过程示意图3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，
4、通过辐射跃迁电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光发光)和和无辐射跃迁等方式失去能量无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。对大。荧光：荧光：1010-7-710 10-9-9 s,s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：1010-4-410s10s；第一激发三重态的最低振动能级；
5、第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光波长的第二单色器；先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下氙灯点灯按钮，当氙灯点燃后，再接通主开关（MAIN）。根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种。（目的是仅让风扇工作，使灯室散热）最后关闭电源开关。基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。蒽的激发光谱和荧光光谱四、影响荧光强度的因素基态
6、上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；(2)生物与有机化合物的分析60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱 荧光：荧光：光致发光光致发光，照射光波长如何选择？，照射光波长如何选择？1.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发射的荧光强度化合物发射的荧光强度与
7、照射光波长的关系曲线与照射光波长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长固定激发光波长(选选最大激发波长最大激发波长),),化合物化合物发射的荧光发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线II或或III)。3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值
8、。发射光谱的波长比发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生产生不同吸收带，不同吸收带，但均回到第一激发但均回到第一激发单重态单重态的最低振动能级再跃的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。镜像
9、规则的解释 基态上的各振动能级分布基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级与第一激发态上的各振动能级分布类似；分布类似；基态上的基态上的零振动能级与零振动能级与第一激发态的第一激发态的二振动能级之二振动能级之间的跃迁几率间的跃迁几率最大，相反跃最大，相反跃迁也然迁也然。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构。）具有合适的结构。（2）具有一定的荧光量
10、子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：吸收的光量子数发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动
11、，减少与溶剂的相互作）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增上有供电基，使荧光增强。强。基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测
12、定。荧光(磷光)的激发光谱曲线分子产生荧光必须具备的条件激发光谱与发射光谱的关系根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射荧光，如色胺酸中的重铬酸钾。既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。分子产生荧光必须具备的条件蒽的激发光谱和荧光光谱四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.1.溶剂
13、的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。率增加。3.3.溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；4.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用：内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射荧溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射荧光，如色胺酸中的重铬酸
14、钾。光，如色胺酸中的重铬酸钾。自吸现象：自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭；碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。二、仪器结构流程二、仪器结构流程 荧光仪主要由荧光仪主要由四个部分四个部分组成：激发光源、样品池、双单组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。色器系统、检测器。特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单色器：单色器：选择激发光波长的选择激发光波长的
15、第一单色器和选择发射光波第一单色器和选择发射光波长的第二单色器；长的第二单色器；光源：光源：氙灯和高压汞灯，染氙灯和高压汞灯，染料激光器料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。（目的是仅让风扇工作，使灯室散热）最后关闭电源开关。先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下氙灯点灯按钮，当氙灯点燃后，再接通主开关（MAIN）。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射荧光，如色胺酸中的重铬酸钾。缺点：应用范围小。蒽的激发光谱和荧光光谱既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图(2)生物与有机化合物的分
16、析二、激发光谱与荧光光谱激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；二、激发光谱与荧光光谱基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；浓度很低时，将括号项近似处理后：激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。仪器光路图同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种。和固定能量差及可变波长三种。同步扫描技术可简化光谱：同步扫描技
17、术可简化光谱：谱带谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。如图。合适的合适的可可减少光谱重叠：减少光谱重叠：酪氨酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但光谱严重重叠，但15nm60nm60nm时，时，只显示只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测色氨酸的特征光谱，实现分别测定。定。可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.当电源开关关闭后5秒钟，再次接通10分钟。S0T1 禁阻跃迁；激发光谱与发射光谱之间的波长差值。固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的
18、荧光强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。二、激发光谱与荧光光谱基本流程如图：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；可测量约60多种元素。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。If=Ia荧光分析法的应用有哪些方面。60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。大多数有机分子的基态处于单重态；可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图日立日立F-4500F-4500荧光仪荧光仪荧荧光光仪仪主主机机电电源源开开关关光源开关光源开关主机开关主机开关n开机顺序：开机顺序：q开机前首先确认主机
19、两个开关：开机前首先确认主机两个开关：POWER/MAIN均处于关闭状态均处于关闭状态（搬向（搬向O处）。处）。q先接通电源开关（先接通电源开关（POWER），），5秒钟后再按下氙灯点灯按钮，当秒钟后再按下氙灯点灯按钮，当氙灯点燃后，再接通主开关（氙灯点燃后，再接通主开关（MAIN）。此时主开关上方绿色指示）。此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下。灯连续闪动三下。q接通电脑及打印机电源，接通电脑及打印机电源，Win98开始建立，随后开始建立，随后F-4500操作界面自操作界面自动进入。动进入。q按界面提示选择操作方式。按界面提示选择操作方式。n关机顺序：关机顺序：q逆开机顺序实施操作。逆开机顺
20、序实施操作。q当电源开关关闭后当电源开关关闭后5秒钟，再次接通秒钟，再次接通10分钟。（目的是仅让风扇工分钟。（目的是仅让风扇工作，使灯室散热）最后关闭电源开关。作，使灯室散热）最后关闭电源开关。日立日立F-4500F-4500荧光分光光度计简易操作方法荧光分光光度计简易操作方法三、荧光分析方法与应用三、荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什么？个数量级；为什么？检测下限：检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.05mol/L 0.05mol/L
21、奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点：缺点：应用范围小。应用范围小。60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。当电源开关关闭后5秒钟，再次接通10分钟。碰撞猝灭；60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图(2)生物与有机化合物的分析（目的是仅让风扇工作，使灯室散热）最后关闭电源开关。根据激发和发射单色器在扫描
22、过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种。分子能级比原子能级复杂；(1)无机化合物的分析荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下。二、激发光谱与荧光光谱2.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将
23、括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表 测测 试试 题题1.1.简述荧光产生过程。简述荧光产生过程。2.2.荧光仪是由哪几部分组成？荧光仪是由哪几部分组成？3.3.简述日立简述日立F-4500F-4500荧光分光光度计开关机的荧光分光光度计开关机的顺序。顺序。4.4.荧光分析法的应用有哪些方面。荧光分析法的应用有哪些方面。5.5.荧光分析的特点有哪些？荧光分析的特点有哪些？
