1、POWER038.PPTl1958 Spackman,Stein and Moore 第一次第一次实现实现氨基酸自氨基酸自动动分离和定量分离和定量 NH2 R C COOH HUV-210nmPOWER038.PPTl柱后衍生柱后衍生l柱前衍生柱前衍生氨基酸氨基酸衍生化后的氨基酸衍生化后的氨基酸试剂试剂色色谱谱柱柱检测检测器器色色谱谱柱柱检测检测器器POWER038.PPT氨基酸氨基酸试剂试剂色色谱谱柱柱检测检测器器色色谱谱柱柱:阳离子交阳离子交换换柱柱试剂试剂:茚茚三三酮酮方法方法-UV/VIS 检测检测器器 OPA方法方法-荧荧光光检测检测器器POWER038.PPT阳离子交阳离子交换换柱
2、柱使用阳离子交使用阳离子交换换柱，峰分离度柱，峰分离度较较差。差。分析所有的氨基酸所需分析所有的氨基酸所需时间较长时间较长。蛋白蛋白质质水解氨基酸水解氨基酸(45 min)生物体氨基酸生物体氨基酸(120 min)POWER038.PPT伯氨基酸和仲氨基酸（伯氨基酸和仲氨基酸（亚亚氨基酸）氨基酸）检检 测测:440nm(脯脯 氨氨 酸酸)or 570nm(primary)反反应应温度温度:130 反反应应速度速度:快快 速速 试剂稳试剂稳定性定性:不不稳稳定（定（必必须须冷藏）冷藏）衍生化衍生化产产物物稳稳定性定性:稳稳定定POWER038.PPT 阳离子交阳离子交换换柱柱UV/VIS检检 测
3、测 器器 茚茚三三酮试剂酮试剂130 氨基酸氨基酸 柱温箱柱温箱 反反应应器加器加热热器器POWER038.PPT伯氨基酸伯氨基酸 检检 测测：荧荧光光检测检测器器(Ex=350nm,Em=460nm)反反应应温度：温度：室室 温温 反反应应速度：速度：快快 速速 试剂稳试剂稳定性定性:较较 差差 衍生化衍生化产产物物稳稳定性：定性：较较 差差POWER038.PPTl 脯氨酸和脯氨酸和羟羟基脯氨酸不与基脯氨酸不与OPA试剂试剂 发发生反生反应应l 在与在与OPA反反应应前两种氨基酸前两种氨基酸应应先使先使 用下列用下列试剂进试剂进行氧化行氧化 次次氯氯酸酸盐盐 氯氯胺胺TPOWER038.P
4、PTl 有硫醇存在有硫醇存在时时，OPA才会与伯氨基酸才会与伯氨基酸发发生反生反应应 乙硫醇乙硫醇2-硫基乙醇硫基乙醇3-硫基丙酸硫基丙酸 (非挥发性)POWER038.PPT 阳离子交阳离子交换换柱柱 荧荧光光检测检测器器 氨基酸氨基酸 柱温箱柱温箱OPA 试剂试剂 次次氯氯酸酸盐盐POWER038.PPT茚三酮茚三酮OPA反应反应一，二级氨基酸一，二级氨基酸一级氨基酸一级氨基酸反应温度反应温度130 C室温室温反应速度反应速度快快快快检测器检测器UV-VIS检测器检测器荧光检测器荧光检测器反应物稳定性反应物稳定性不稳定不稳定稳定稳定POWER038.PPT 衍生化后的氨基酸衍生化后的氨基酸
5、 色色 谱谱 柱柱 检检 测测 器器 色色 谱谱 柱柱:反相柱反相柱(ODS)试试 剂剂:OPA(荧荧光光检测检测)FMOC(荧荧光光检测检测)荧荧 光光 胺胺(荧荧光光检测检测)DANS-Cl(荧荧光光检测检测)PITC(UV)POWER038.PPT 反相色反相色谱谱柱柱(ODS)使用反相柱，色使用反相柱，色谱谱峰分离良好。峰分离良好。分析某些类型的氨基酸所需分析某些类型的氨基酸所需时间时间很短很短 蛋白蛋白质质水解氨基酸水解氨基酸(20 min)生物体氨基酸生物体氨基酸(60 min)POWER038.PPT伯氨基酸伯氨基酸检测检测:荧荧光光检测检测器器(Ex=380nm,Em=420n
6、m)反反应应温度：室温温度：室温反反应应速度：快速速度：快速POWER038.PPT生物体氨基酸生物体氨基酸标标准品准品Shim-pack CLC-ODSPOWER038.PPT通用通用试剂试剂，用于，用于缩缩氨酸氨酸 N端保端保护护POWER038.PPTlpH7时时与伯氨基酸快与伯氨基酸快速反速反应应l易于水解易于水解POWER038.PPTl与伯氨基酸和仲氨与伯氨基酸和仲氨基酸反基酸反应应效率低效率低POWER038.PPTlFor peptide and protein sequencing as Edman抯抯 reagentl伯氨基酸和仲氨基酸伯氨基酸和仲氨基酸(碱碱性条件性条件)
7、l反反应时间长应时间长l使用使用UV检测检测器，灵敏度器，灵敏度低低PITCPTCPOWER038.PPTSTR ODS-II氨基酸氨基酸标标准品准品POWER038.PPTl对对于于“柱前柱前”和和“柱后柱后”自自动动氨基酸分析氨基酸分析仪仪来来说说，采用何种方法更好？，采用何种方法更好？l要控制反要控制反应时间应时间，采用柱后衍生方法更方，采用柱后衍生方法更方便。便。这这就是就是为为什么采用柱后衍生法所得什么采用柱后衍生法所得结结果之重复性更好的原因。果之重复性更好的原因。v柱后衍生重复性柱后衍生重复性,RSD 约为约为 1%v柱前衍生重复性柱前衍生重复性,RSD 2%POWER038.P
8、PTPOWER038.PPTPOWER038.PPTl强酸性阳离子交强酸性阳离子交换树换树脂脂 (带带有磺化基有磺化基团团的苯乙的苯乙烯烯二乙二乙烯烯基苯共聚物基苯共聚物)lNa型型 and Li型型vShim-pack AMINO-Na，用于水解氨基酸分析，用于水解氨基酸分析vShim-pack AMINO-Li，用于生物体氨基酸分析，用于生物体氨基酸分析POWER038.PPTPOWER038.PPTPOWER038.PPT Na型型 A 溶液溶液:0.2N 柠柠檬酸檬酸钠钠 (用高用高氯氯酸酸调调 pH至至 3.2)B 溶液溶液:0.6N 柠柠檬酸檬酸钠钠/0.2M 硼酸硼酸 (用用4M
9、 NaOH调调 pH至至 10.0)C溶液溶液:0.2N NaOH(用于清洗色用于清洗色谱谱柱柱)Li 型型A 溶液溶液:0.15N 柠柠檬酸檬酸锂锂/7%甲氧基乙醇甲氧基乙醇 (用硼酸用硼酸调调 pH至至 2.6)B溶液溶液:0.3N 柠柠檬酸檬酸锂锂/0.2M 硼酸硼酸 用用4M LiOH调调 pH至至 10.0)C 溶液溶液:0.2N LiOH(用于清洗色用于清洗色谱谱柱柱)POWER038.PPT H H H R-C-COOH R-C-COOH R-C-COO-NH3+NH2 NH2分离是通分离是通过过 离子力离子力进进行的行的POWER038.PPTPOWER038.PPT流流动动相
10、中的氨相中的氨 无捕集柱无捕集柱有捕集柱有捕集柱POWER038.PPTRretention timeArea value Retention timeretention timeArea valueAsparatic acid0.21.2Methionine0.41.1Threonine0.21.0Isoleucine0.30.9Serine0.21.3Leucine0.41.3Glutamic acid0.21.3Tyrosine0.31.2Proline0.20.9Phynylalanine0.31.3Glycine0.20.9Histidine0.11.1Alanine0.31.0Ly
11、sine0.11.5Cystine0.41.6Arginine0.10.9Valine0.41.0(n=10)POWER038.PPTPOWER038.PPT25 pmol 氨基酸氨基酸标标准品准品POWER038.PPTl脱脂脱脂 l去蛋白去蛋白l蛋白蛋白质质水解水解l样样品稀品稀释释l过滤过滤POWER038.PPTl脂类脂类组组分会影响分析柱分会影响分析柱l使用弱极性溶使用弱极性溶剂剂v乙酸乙乙酸乙酯酯v氯氯仿仿v正己正己烷烷等等l两相分离后两相分离后,水相必水相必须须使用使用0.45 um 滤滤膜膜过过滤滤POWER038.PPTl蛋白蛋白组组分会干分会干扰扰氨基酸的分离氨基酸的分离l
12、除蛋白除蛋白试剂试剂v酸性溶酸性溶剂剂方法方法v有机溶有机溶剂剂方法方法v超超滤滤方法方法l蛋白沉淀物必蛋白沉淀物必须须采用离心采用离心(3000 rpm,5 min)或或过滤过滤方法除去方法除去.POWER038.PPTl三三氯氯乙酸乙酸(5-10%水溶液水溶液)l高高氯氯酸酸(0.1-1%水溶液水溶液)l除去蛋白后除去蛋白后,通通过过加加 NaOH or LiOH 以中以中和和溶液溶液 (溶液呈酸性溶液呈酸性时时会影响色会影响色谱谱保留保留时间时间.)POWER038.PPT乙乙腈腈乙醇乙醇聚苯乙聚苯乙烯烯柱不适合用有机溶柱不适合用有机溶剂剂。如果采用有机溶如果采用有机溶剂剂方法方法,进样
13、进样量量应应尽可能小。尽可能小。POWER038.PPTPOWER038.PPTPOWER038.PPTPOWER038.PPTPOWER038.PPTPOWER038.PPT高高氯氯酸水解方法酸水解方法v6N-HCl 110C(N2氛氛围围)22-72 hoursl色氨酸色氨酸,半胱氨酸半胱氨酸,蛋氨酸蛋氨酸分析不能用此水分析不能用此水解方法解方法(可用其它方法可用其它方法).l天冬天冬酰酰胺酸和胺酸和 谷氨酸谷氨酸 转换转换成酸的形式。成酸的形式。POWER038.PPT碱水解方法碱水解方法v4N NaOH 110C(N2 氛氛围围)16-24 hoursl这这一方法用于一方法用于色氨酸色
14、氨酸POWER038.PPT过过甲酸氧化方法甲酸氧化方法vA/B=5/95 110C(N2 氛氛围围)A:30%过过氧化氧化氢氢B:90%甲酸甲酸 22-72 hl这这一方法用于一方法用于 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸酸分析分析POWER038.PPT从胰腺得到的胰从胰腺得到的胰岛岛素中素中的水解氨基酸分析的水解氨基酸分析POWER038.PPTPOWER038.PPT意大利草中水解氨基酸分析意大利草中水解氨基酸分析POWER038.PPT人人发发中水解氨基酸分析中水解氨基酸分析POWER038.PPT0.2N 柠柠檬酸檬酸钠缓钠缓冲液冲液(pH 2.2)0.2N 柠柠檬酸檬酸锂缓锂缓冲液冲液(pH 2.2)用于稀用于稀释样释样品品稀稀释释后的最佳后的最佳浓浓度度约为约为 5 nmol/ml-10 m mmol/ml.POWER038.PPT进样进样前前应应使用使用 0.45 m mm孔径的孔径的滤滤膜膜过滤样过滤样品品
