1、第三章核酸的分离与分析 第一节 核酸的分离纯化一、核酸分离提取的原则与要求 二、核酸提取的主要步骤 三、质粒DNA的分离纯化四、基因组DNA的制备 五、RNA的提取六、核酸的定量一、核酸分离提取的原则要求总的原则：保证核酸一级结构的完整性，防止降解，排除其它分子的污染。如：防止核酸酶，特别是RNase的污染，又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。二、核酸提取的主要步骤1.样品准备2.细胞破碎3.分离纯化核酸4.核酸的沉淀浓缩1.样品准备 新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。动物细胞：胰酶消化，离心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀的细胞。液体
2、培养的微生物：直接离心沉淀收集菌体。2.细胞破碎物理方法、化学方法、酶法等。物理方法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法等。（注意：物理方法容易导致DNA链的断裂）化学方法和酶法：去污剂（SDS 0.5%1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K温和裂解。EDTA（5mmol/L)作用：与Mg2+结合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加入适量RNA酶。3.分离纯化核酸 关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。酚/氯仿抽提法：酚、氯仿:两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。细胞破碎酚/氯仿水相（DNA、小分子RNA）界面（絮状蛋白质沉
3、淀）有机相（色素、脂类、糖类）酚酚/氯仿提取除蛋白质原理示意图氯仿提取除蛋白质原理示意图细胞悬浮液细胞抽提物4.核酸的沉淀浓缩 乙醇沉淀法：无水乙醇结合核酸分子所结合的水，使核酸沉淀。微量的DNA，可加入中等浓度的单价阳离子促进沉淀。如Na+，中和DNA分子上的负电荷，减少了DNA分子间的同性电荷相斥力。三、质粒DNA的分离纯化重点考虑如何与基因组DNA相互分开。利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法等。1.碱裂解法：小量制备DNA较好的方法。基本原理：在
4、碱性pH（12-12.5）下，DNA分子均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一起，能准确复性而留于上清溶液中。2.煮沸法 利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进行分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相中，通过高速离心（12,000 g）可实现分离。适于快速提取质粒 DNA并进行鉴定，也适用于大量提取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。3.CsCl-EB密度梯度平衡离心 CsCl是一种大分子量的重金属盐，长时间超速离心时，在管中形成11.8052g/cm3自上而下增加的密度
5、梯度。染色体DNA、质粒DNA、RNA以及蛋白质等，可在离心管内不同位置形成区带。RNA可与Cs+结合，因此密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。四、基因组DNA的制备基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上蛋白酶K温和裂解方法。杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。五、RNA的提取细胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分开，可先制得细胞核、线粒体、核糖体等细胞器
6、和细胞质，然后再从中分离某一类RNA。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱柱分离。RNA的提取要点：样品细胞或组织的有效破碎；核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；对RNA酶的有效抑制；将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。最关键的是抑制RNA酶的活性。六、核酸的定量核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光度法。紫外分光光度法核酸的最大吸收波长是260nm，吸收波谷在230nm。根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度
7、相当于双链DNA浓度为50gmL；单链DNA或RNA为40gmL；单链寡核苷酸为20gmL。可以此来计算核酸样品的浓度，检测最低限为0.51.0gmL。通过测定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若A样品的比值高于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留酚或蛋白质。荧光分光光度法DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。由此可建立标准曲线，测定未知样品的浓度。第二节 核酸的凝胶电泳 电泳：是利用带
8、电荷物质的电场中的迁移速率的不同而将其分离的方法。凝胶电泳：利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的大分子物质得以分离并在保留于凝胶中，在不同位置形成条带。电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值（荷质比）相关。在中性pH或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极向正极迁移。在均一的凝胶网络中，核酸的迁移速率只与分子的大小相关，使不同分子量者分开，而相同分子量聚集形成条带。一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：形成的凝胶具有大量微孔，其孔径尺寸取决于它的浓度，如0.75%琼脂糖的孔径为800 nm，1%琼脂糖孔径为150nm；透明，无紫外吸
9、收；无毒，热熔冷凝，制胶方便；热可逆性，具有一定强度。琼脂糖凝胶的制备：将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围琼脂糖浓度（%）分离线状DNA分子的范围（kbp）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13凝胶电泳成像图谱二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂（crosslinker）N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称B
10、is）交联成的三维网状结构的凝胶。该凝胶孔径小、透明、弹性好、无紫外吸收，可用于DNA、蛋白质等的分离。DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围聚丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围（bp）3.510010005.0805008.06040012.04020020.010100三、凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化方法：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法等。DEAE纤维素膜插片法简便易行，回收率、纯度都很高，对回收500bp5kb左右大小的DNA片段效果很好。电泳洗脱法对大于5kb的DNA片段较适合。冻融法、SDS溶液浸出法等方法都极为简便，
11、但纯度与回收率较差。将低熔点琼脂糖挖块与玻璃奶法结合，可回收到质量较好的DNA片段。第三节 聚合酶链式反应（polymerase chain polymerase chain reactionreaction，PCRPCR）概念:在引物存在的条件下、以DNA为模板、由DNA聚合酶催化的对特定基因或DNA序列进行体外快速扩增的反应，故又称为基因的体外扩增法。美国美国Cetus公司科学家公司科学家K.B.Mullis于于1983年发明年发明 一、PCR技术的基本原理及特点双链DNA分子在临近沸点的温度下便会分离成两条单链的DNA分子，当温度降低时，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的
12、引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链。室温下开始94变性（1min）60退火（1min）72延伸（1.5min）温度（）607294循环1循环2循环3时间（min）PCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106107倍的扩增。正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，意味着分子生物学分析只需要含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹等。这对于法医学鉴定具有特别的应用价值。同时，应当注意，任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生污染，确保实验结果的准确、可靠。二、PCR反应体系与条件优化标准的PCR反应体系：
13、50l 100l体积，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA聚合酶（2.5U），2条引物（各0.25mol/L），KCl（50 mmol/L），TrisHCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5 mmol/L），明胶或牛血清白蛋白（BSA）（1g/ml）。1.PCR反应模板（1）种类：可来自任何生物的单链或双链DNA，也可以是用化学方法合成的。（2）数量：一般而言，PCR检测可以用纳克（ng）级的DNA克隆模板或微克（g）级的基因组DNA，或者是拷贝数为105的目的DNA片段。（3）纯度：对样本纯度的最基本要求：一是要含有至少一个包含有待扩增片段的完整的分子，二是
14、其他的不纯物的浓度不会抑制酶的活性。传统的DNA纯化方法完全可以满足PCR反应要求。2.PCR反应的缓冲液PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素。Mg2浓度非常重要，它是PCR反应中DNA聚合酶的辅助因子。反应体系中许多成分都结合Mg2，包括引物、模板、PCR产物和dNTP。通常，Mg2的总浓度必须超过dNTP的总浓度。在一般的PCR反应中，1.52.0 mmol/L Mg2是比较合适的（对应dNTP浓度为200 mol/L左右）。3.底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度PCR反应中，dNTP浓度应在20200mol/L，高浓度dNTP可加快反应速度，但同时会增加碱基的错误掺入率和实验成
15、本；低浓度dNTP虽会导致反应速度下降，但可提高实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注意二者浓度之间的关系。4.PCR反应的DNA聚合酶100l反应体系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量为0.55U。根据扩增片段的长短及其复杂程度（GC含量）不同而有所区别。使用Taq DNA聚合酶浓度过高，会引起非特异产物的扩增；浓度过低则合成产物量减少。5.PCR反应的引物（1）引物设计原则PCR引物通常长1525碱基，其中GC约占50%。引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。引物的3末端必须与目的片段完
16、全相配。引物的5末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。（2）引物Tm加热可以打开双链结构，当一半分子为单链而另外一半分子仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA的熔解温度，即Tm。由于GC碱基对间的氢键数较AT碱基对间的多，故GC含量高的DNA的Tm值也较高。PCR反应中引物浓度一般为0.10.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，同时会增加引物之间形二聚体的几率。6.PCR反应条件的选择94，30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。复性温度的选择，可以根据引物的长度及其GC含量确定。长度在1525bp之间时，退火温度
17、可通过Tm=4（GC）2（AT）计算得到。退火时间设置为30秒钟。PCR反应的延伸温度建议选择的72，此时，Taq DNA聚合酶具有最高活性。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的片段，延伸时间1分钟即可，扩增10kb片段时，其延伸时间可达到15分钟。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上2025次循环之后，PCR产物的积累即可达到最大值。三、PCR技术拓展与应用包括：锚定锚定PCRPCR（anchored PCR），反向反向PCRPCR（reverse PCR），不对称不对称PCRPCR（asymmetric PCR），RT-PCRRT-PCR，多重多重
18、PCRPCR（multiplex PCR）等。1.反向PCR（reverse PCR）反向PCR用于扩增位于靶DNA区段之外的两侧的未知DNA序列。2.不对称PCR（asymmetric PCR）不对称PCR技术（asymmetric PCR）可用于制备单链模板DNA。方法中的两种引物浓度相差100倍，其它方面与标准PCR并没有本质的区别。低浓度引物的叫限制引物，一般为0.51.0 pmol。在限制引物被用完之前，PCR扩增产物当中主要是双链DNA，而且以指数方式上升。大约25个循环后，只剩下的高浓度的引物。此时的PCR扩增产物则只有双链DNA中的某一条链，以线性而非指数方式增加。3.RT-P
19、CRPCR技术用于扩增被反转录成cDNA形式的特定RNA序列，称为RT-PCR。4.多重PCR（multiplex PCR）同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。主要应用领域是检测特定序列的存在或缺失。若待检测的基因片段存在，经PCR可以产生扩增区带；而如果该段缺失，则PCR反应后不出现扩增区带。第四节 核酸分子杂交技术根据核酸变性和复性的性质，应用核酸探针检测靶基因或靶序列的技术方法，是分子生物学领域应用最为广泛的技术之一。具有灵敏度高、快捷、简便易行等优点，被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突变的检测等。一、核酸杂交的原理 利用具有同
20、源性的两条核酸单链在一定的条件下退火，可按碱基互补原则形成双链，如果这两条链的来源不同，则形成杂交分子。核酸分子杂交实验通常包括两步：核酸印迹核酸印迹（nucleic acid blotting）转移：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上。主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和噬菌斑印迹法菌落和噬菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；杂交反应：将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸分子杂交为印迹杂交。二、核酸探针的制备核酸分子探针核酸分子
21、探针:是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物（即标记物）进行标记。探针的种类及其选择 根据来源及其性质:基因组DNA探针：cDNA探针：RNA探针：人工合成的寡核苷酸探针 注意:并不是任意一段核酸片度都可以作为探针的。探针的选择正确与否，会直接影响杂交结果的分析。各种标记物及其选择 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：标记前后探针的基本结构不变，标记物不影响探针的化学性质、杂交特异性、Tm值等；可以通过采取一定措施达到较高的灵敏度（如延长曝光时间或用增感屏来增加讯号的强度
22、）；特异性强、本底低，重复性好，并且操作简单、省时；稳定、安全、经济、无污染。目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性和非放射性两大类。容易造成放射性污染；当标记活性极高时，放射线会造成核酸分子结构的破坏；多数放射性核素的半衰期都比较短，必须随用随标记，标记后立即使用，不能长期存放（3H与14C除外）。1.放射性核素 放射性核素的灵敏度极高，可检测到1041018g的物质，但存在以下缺点：2.非放射性标记物 生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、荧光素等 多数非放射性标记探针的敏感性较差，但稳定性好、分辨力高、检测所需的时间短，尤其是操作过程中不需要放射性
23、防护设备，在安全方面大大优于放射性标记探针。（三）探针的标记方法 放射性标记分为体内标记法及体外标记法两种，而基因工程中常用体外标记。体外标记法又分为化学法和酶法两种。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法标记是先将标记物标记在核苷酸上，然后在通过酶促聚合反应使带有标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生标记核酸探针。常用的酶法标记有切口平移法（nick translation）和随机引物法（random priming），这两种方法均为均一标记。此外还有一种是利用多核苷酸激酶的末端标记法，为不均匀标记。1.切口平移法2.随机引物法随机
24、引物法优点：模板的纯度不需很高即可标记；反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量；标记探针的比活较高，可达到4109cpm/g；该法可以在低熔点的琼脂糖中进行。3末端标记可使用末端转移酶，-32PdNTP加到寡核苷酸的3末端，可以加上单个或多个标记物，多个标记物的加入可以提高探针的比活。5端标记，标记物常用-32PATP。T4多聚核苷酸激酶3.末端标记法非放射性标记探针的检出 目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应结合的策略，杂交信号的检出依赖于酶反应，其中酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测。三、核酸杂交种类与方法（1）固相杂交，也称为膜上印迹杂交，包括Southern印
25、迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。（2）细胞原位杂交，标记已知序列的核酸，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。（3）液相杂交。膜上印迹杂交膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。这种膜上印迹杂交的技术也称印迹技术。根据核酸分子的种类不同，印迹技术（或方法）分为Southern印迹和Northern印迹。根据核酸转移方式的不同也有不同的印迹方法：斑点或狭缝印迹法；虹吸转移印迹方法；电转移印迹方法；真空转移印迹方法。印迹杂交实验中，选择有效的转移方法和
26、良好的固相支持物此项技术成败的关键。1.固相支持物的选择固相支持物的选择固相支持物种类很多，一种良好的固相支持物应具备以下几个特点：具有较强的结合核酸分子的能力；与核酸分子结合后，应不影响与探针分子的杂交反应；与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作而不致于脱落或脱落极少；非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。2.Southern印迹杂交（1）原理 Southern印迹是由Southern于1975年发明建立，是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。（2）Southern印迹杂交流程S
27、outhern印迹杂交分析主要包括以下主要步骤：酶解。电泳。转膜。预杂交。探针标记。杂交。杂交检出。（1）Northern印迹杂交的原理提取植物总RNA或mRNA，用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，原位转移至固相膜，在适宜的离子强度及温度条件下，探针与膜上的同源序列杂交形成RNADNA杂交双链，通过探针的标记性质可以检出杂交体。根据杂交体在膜上的位置可进一步分析杂交RNA的大小。若经过上述杂交操作膜上没有出现杂交带，说明外源基因虽然已整合到植物染色体上，但在该取材部位及生理状态下并未有效表达。3.Northern印迹杂交细胞总RNA或mRNA与探针的杂交的印迹
28、过程。（2）Northern印迹杂交程序基本程序与Southern印迹杂交一样，只是电泳分离有较大差别，Southern印迹杂交是用普通琼脂糖凝胶分离DNA分子，而Northern印迹杂交则是用变性凝胶电泳来分离RNA分子。RNA电泳时必须注意两个问题：防止单链RNA形成高级结构，所以必须采用变性凝胶；电泳过程中始终要有效抑制RNA酶的作用。4斑点杂交斑点杂交是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行
29、杂交。（二）菌落原位杂交 菌落原位杂交是DNA探针与菌落DNA的杂交，于1975年，由M.Grunsyein和D.Hogness提出。具体做法是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA与滤膜原位结合，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，故称为菌落原位杂交。检测重组体克隆的菌落原位杂交技术（a）将滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上；（b）取出滤膜，作溶菌、碱变性、酸中和等处理后，置80烤干；（c）带有DNA印迹的滤膜与标记的探针杂交，以检测带有重组质粒（含有目的DNA插入片
30、段）的阳性菌落；（d）将放射自显影的X光片与原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落。（三）组织原位杂交组织原位杂交组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此组织原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。（四）固相夹心杂交固相夹心杂交需要两个靠近而又互相重叠的探针，一个做固相吸附探针，另一个作标记检测探针，样品基因组内核酸只有使这两个探针
31、紧密相连才能形成夹心结构，需要注意的是两探针必须分别亚克隆进入两个分离的非同源载体内，以避免产生高的本底信号。夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点：（1）样品不需固定，对粗制样品能做出可靠的检测；（2）用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强，因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。（五）液相核酸分子杂交类型1.吸附杂交（1）HAP吸附杂交，羟基磷灰石层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法，在液相中杂交后，DNA DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上，通过离心使吸附有核酸双链HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP，然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。（2）亲和吸附杂交：生
32、物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲和素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗DNA RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应，加入酶显色底物。这个系统可快速（2h）检测RNA。（3）磁珠吸附杂交：Gen-Probe公司最近应用丫啶翁酯（Acridinium ester）标记DNA探针、这种试剂可用更敏感的化学方法来检测，探针和靶DNA杂交后，杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠（阳离子磁化微球体）上，溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出，经过简单的漂洗步骤，吸附探针的小珠可用化学发光测定。2.发光液相杂交（1）能量的传递法 Heller等设计用两个紧接的探针
33、，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近，两个靠得很近的探针用不同的物质标记（光发射标记）。当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近，一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节检测器使自动记录第二次发射光的波长，只有在两个探针分子靠得很近时，才能产生激发光，因此这种方法具有较好的特异性。（2）丫啶翁酯标记法 丫啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后，未杂交的标记探针分子上的丫啶翁酯可以用专门的方法选择性除去，所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低（1ng的靶核酸），仅适用于检测扩增的靶序
34、列，如rRNA或PCR扩增产物。3.液相夹心杂交（1）亲和杂交 在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构。杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。（2）采用多组合探针和化学发光检测 第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们有50个碱基长，其中含有30个细菌特异序列碱基和20个碱基的单链长尾；第二类探针是固相吸附探针，它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多体（标记探针），液相吸附探针和靶DNA杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上。4、复性速率液相分子杂交这个方法的原理是细菌
35、等原生物的基因组DNA通常不包含重复顺序，它们在液相中复性（杂交）时，同源DNA比异源DNA的复性速度要快，同源程度越多，复性速率和杂交率越快。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测量变性DNA在一定条件下的复性速率，进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交（结合）度。本章小结基因工程中基本的技术方法：核酸的分离纯化，凝胶电泳，PCR技术及核酸杂交。核酸分离纯化：酚/氯仿法是核酸提取中常用的除蛋白质方法。小量质粒的提取可用碱裂解法，而煮沸法可用于质粒的快速提取。核酸分子片段的大小的鉴定则可用琼脂糖凝胶电泳的方法。PCR技术及核酸杂交技术是应用范围最为广泛两种技术。PCR使得特定的
36、DNA在体外得以分离并扩增。核酸杂交技术是生物芯片技术的核心，通过杂交可鉴定出某个特定片段是否含有某一特定的核苷酸序列，而对片段的最终确定则需进行DNA测序。本章思考题：1.核酸分离纯化应注意哪些事项？一般的分离纯化分为哪些步骤？各步的要点是什么？2.质粒纯化可采用什么方法？简述各方法基本原理。3.哪些因素会影响RNA的提取，简述与DNA提取的不同之处？4.不同大小分子核酸电泳分离的原理是什么？琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么特点？各自的适应范围？核酸电泳有哪些检测方法？5.核酸片段回收的目的是什么？有哪些方法？6.PCR反应的基本原理是什么？每个循环包括哪些步骤？有何应用价值？7.影响PCR效率的因素有哪些？试分析单次PCR是否可实现DNA量的无限增长。8.PCR反应为什么不使用DNA聚合酶？Taq酶有什么不足之处？如何解决？9.PCR的引物设计应遵守哪些原则？如何优化体系的反应条件？10.解释以下名词：反向PCR，不对称PCR，反转录PCR，多重PCR
