1、逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠性激素及乳腺癌细胞ER亚型影响的对比研究中国中医科学院广安门医院赵 炜2010年5月研究背景 乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，近30年来，乳腺癌发病率一直居女性肿瘤首位，我国乳腺癌的发病率急剧上升，据统计2006年已达到52/10万。ER阳性的乳腺癌患者需要35年的内分泌治疗，目前绝经期前患者常用药为他莫昔芬（TAM），主要副作用有：食欲不振、恶心、眩晕、抑郁、面部潮红、皮疹等。我国大部分乳腺癌患者都接受中西医结合治疗，在手术后、放化疗期间、内分泌治疗期间及晚期姑息治疗中，中药均全程参与并起着重要作用。尤其内分泌治疗副反应，中医辨证属中医肝郁、冲任失调证，常以逍遥散、二仙汤
2、为母方加减。大量临床及实验研究表明疏肝、补肾方剂如逍遥散、二仙汤、乌鸡白凤丸、六味地黄丸等对女性激素均有调节作用。这些调节作用机理一方面与下丘脑垂体卵巢轴有关，另一方面也与复方中单药所含植物雌激素有关。己证实植物雌激素对机体具有类雌激素和/或抗雌激素活性的双重作用。因此，植物雌激素既能作为雌激素又能作为抗雌激素使用。5060的乳腺癌是激素依赖性的，雌激素通过与ER（主要是ER ）相结合，在乳腺癌的发生中起主要作用。可直接和间接促进癌细胞的增殖。研究背景 长期服用疏肝解郁、调理冲任中药治疗乳腺癌或减轻内分泌药物副反应的同时，是否会改变雌孕激素水平？以及改变ER亚型比例？中药方剂中植物雌激素对激素
3、敏感性乳腺癌是否有促进或抑制作用？中药方剂对雌激素受体拮抗剂他莫昔芬是否有协同或抵消作用？实验内容v逍遥丸浓缩液：根据中华人民共和国药典规定，柴胡、当归、白芍、白术（炒）、茯苓、甘草（蜜炙）、生姜、薄荷（后下），以1.4g/kg换算成大鼠剂量。购自中国中医科学院广安门医院门诊药房，浓煎冷藏保存。v二仙汤浓缩液：根据中药方剂现代研究大典引1973年妇产科学记载：仙茅、仙灵脾、巴戟天、当归、黄柏、知母，以1.4g/kg换算成大鼠剂量。购自中国中医科学院广安门医院门诊药房，浓煎冷藏保存。研究方法和技术路线研究方法和技术路线1 逍遥丸、二仙汤对雌性正常大鼠、卵巢摘逍遥丸、二仙汤对雌性正常大鼠、卵巢摘除
4、大鼠、除大鼠、TAM大鼠血清性激素的影响大鼠血清性激素的影响 Wister 雌性大鼠70只去势术开关术逍遥丸去势组二仙汤去势组空白去势组逍遥丸组逍遥丸TAM组二仙汤组二仙汤TAM组去冠取血，放射免疫法测血清E2、P7d7d30d研究方法和技术路线 统计方法：使用SPSS 14.0统计软件，多组间计数资料先采用方差分析，再用Student-Newman-Keuls检验结 果 逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠雌激素（E2）的影响分组E2（pg/ml）正常组321.11632.399空白手术组186.28933.967逍遥丸组154.98150.477去势逍遥丸182.51639.029逍遥丸TAM组394
5、.28137.804二仙汤组346.42564.530去势二仙汤组259.76637.142二仙汤TAM组510.37282.658对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠E2影响：影响：0 05050100100150150200200250250300300350350正常组正常组逍遥丸组逍遥丸组二仙汤组二仙汤组E2E2逍遥丸可显著降低降低正常雌性大鼠血清E2水平；二仙汤对正常大鼠E2未见明显影响；结 果对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠E2影响：影响：0 05050100100150150200200250250300300350350正常组正常组空白手术组空白手术组逍遥丸去势组逍遥丸去势组二仙汤去势组二
6、仙汤去势组E2E2逍遥丸对去卵巢大鼠E2水平无明显影响；二仙汤可升高升高去卵巢大鼠E2水平；结 果对灌服对灌服TAM雌性大鼠雌性大鼠E2影响：影响：0 0100100200200300300400400500500600600正常组正常组逍遥丸TAM组逍遥丸TAM组二仙汤TAM组二仙汤TAM组E2E2使用TAM使大鼠E2升高；逍遥丸对于TAM引起的E2升高有降低降低作用，二仙汤则无。结 果结 果 逍遥丸、二仙汤对雌性大鼠孕激素（P）的影响分组P（pg/ml）正常组51.8665.429空白手术组60.08513.505逍遥丸组58.33912.741去势逍遥丸47.18810.297逍遥丸TA
7、M组75.75913.664*二仙汤组59.4187.655去势二仙汤组50.0379.521二仙汤TAM组44.7896.531*对正常雌性大鼠对正常雌性大鼠P影响影响：0 0101020203030404050506060正常组正常组逍遥丸组逍遥丸组二仙汤组二仙汤组P P逍遥丸、二仙汤对正常大鼠血清孕激素均无无明显影响结 果对去势雌性大鼠对去势雌性大鼠P影响：影响：0 01010202030304040505060607070正常组正常组空白手术组空白手术组逍遥丸去势组逍遥丸去势组二仙汤去势组二仙汤去势组P P逍遥丸、二仙汤对去势大鼠血清孕激素均无无明显影响结 果对灌服对灌服TAM雌性大鼠
8、雌性大鼠P影响：影响：0 010102020303040405050606070708080正常组正常组逍遥丸TAM组逍遥丸TAM组二仙汤TAM组二仙汤TAM组P P合用逍遥丸组P水平增高增高，合用二仙汤组P水平下降下降结 果在体内雌激素水平正常或偏高的情况下，逍遥丸主要起抑制作用，降低体内雌激素水平；而当体内雌激素显著低于正常或去除卵巢时，逍遥丸并不会使之进一步下降 在去除卵巢后体内雌激素水平低下时，二仙汤可增加E2水平，这种增加并非通过卵巢，是否通过增加芳香化作用尚需进一步实验探讨 使用TAM的大鼠血清雌激素水平较正常均有明显升高，考虑与TAM使用早期与雌激素竞争受体导致血清游离雌激素相对
9、过剩。合用逍遥丸的大鼠血清E2有降低趋势，与逍遥丸可以抑制过高的雌激素水平相吻合。使用TAM的两组大鼠，合用逍遥丸的大鼠P升高，而合用二仙汤的大鼠P降低，推测使用TAM后ER-PR基因抑活，因此孕激素相对增多，逍遥丸对此并无明显作用，而二仙汤可通过高雌激素水平反馈性抑制下丘脑-垂体-卵巢轴降低P水平 逍遥丸、二仙汤对雌、孕激素的影响逍遥丸、二仙汤对雌、孕激素的影响2 2 含逍遥丸、二仙汤血清对含逍遥丸、二仙汤血清对T47DT47D细胞生长及细胞生长及ERER、ERER蛋白表达影响蛋白表达影响 雌激素通过与ER相结合起作用。目前认为雌激素与ER结合在乳腺癌的发生中起主要作用。ER与植物性雌激素的
10、亲和力高于ER ER亚型与乳腺癌的发生：正常乳腺组织中ER表达水平高于ER，且当组织自良性病变发展自到癌变的过程中ER表达下降而ER升高，特别是ER/ER比值下降，于是组织对雌激素反应力即逐渐增加，发生癌变的风险亦逐渐增强。由此，推断ER对维持乳腺组织的正常生理功能起着重要作用。ER亚型与内分泌治疗耐药：目前尚无定论，部分实验显示ER 表达的上调与TAM耐药有关，但部分则认为ER阳性前提下，ER 表达可增加TAM的敏感性研究方法和技术路线Wister大鼠8只灌服逍遥丸4只灌服二仙汤4只去冠取血清30d去激素小牛血清培养的T47D细胞溶剂对照组 0.5%DMSO 雌激素对照组（E2，0.1nmo
11、l/L）逍遥丸血清组（10逍遥丸血清）二仙汤血清组（10二仙汤血清）他莫昔芬组（1.0uMTAM）雌激素+他莫昔芬组 逍遥丸血清+他莫昔芬组 二仙汤血清+他莫昔芬组 96h加入6dMTT法测细胞增殖Western-blot法测定ER、ER蛋白表达结 果 含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47D细胞活性影响分组分组24h MTT值值48h MTT值值72h MTT值值未处理0.2500.0180.3790.0290.4610.047雌激素0.2430.0150.4030.0160.5200.042*逍遥丸0.2570.0170.3670.0340.4760.024二仙汤0.2600.0140.370
12、0.0400.4920.056TAM0.2520.0170.3500.0270.4720.048结 果 72h时，加入雌激素雌激素的T47D细胞MTT活性较未处理组增强增强（p0.05）；加入逍遥丸、二仙汤血清、TAM的细胞活性较未处理组无明显变化无明显变化，各组之间也无统计学差异 含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47D细胞ER 的影响结 果分组ER灰度值溶剂0.8050.092雌激素1.5400.097*逍遥丸1.0050.073二仙汤0.9510.098TAM1.1080.132*v加入雌激素雌激素的细胞ER蛋白表达明显增加，与其他组有明显差异（P0.01）。vTAM也上调了ER蛋白的表达，
13、与溶剂组、二仙汤血清组有明显差异（P0.01）。v逍遥丸、二仙汤血清对ER蛋白表达无明显改变 00.511.52ER图4 对ER蛋白表达的影响溶剂组雌激素组逍遥丸组二仙汤组TAM组结果 含逍遥丸、二仙汤血清对乳腺癌T47D细胞ER的影响 分组ER灰度值溶剂0.9530.096雌激素1.2430.100*逍遥丸1.1120.118二仙汤1.3200.133*TAM1.3210.104*雌激素、二仙汤血清及雌激素、二仙汤血清及TAM均使ER蛋白表达增加，与溶剂组、逍遥丸组有显著差异（P0.01）00.511.5Er图5 对ER蛋白表达的影响溶剂组雌激素组逍遥丸组二仙汤组TAM组结 果含逍遥丸、二仙
14、汤血清对乳腺癌T47D细胞ER/ER比值的影响 分组ER/ER比值溶剂1.184雌激素0.807逍遥丸1.004二仙汤1.388TAM1.315v加入溶剂的T47D细胞，ER和ER蛋白的表达基本相近，ER略多于ER；v加入雌激素的T47D细胞，ER蛋白表达低于ER；v加入逍遥丸血清与溶剂类似，ER和ER蛋白的表达基本相近，ER略多于ER；v加入TAM和二仙汤血清的细胞，ER蛋白的表达明显高于ER。雌激素诱导ER和ER蛋白表达比例的失常或倒置，可能是其促进乳腺癌发生发展的原因之一 TAM诱导ER和ER表达上调，ER/ER比例增加，尚不足以推测是其治疗有效的原因，还是耐药性产生的开始 逍遥丸血清对
15、ER和ER无明显改变；二仙汤血清对ER有特异性的诱导作用，考虑与其方内所含植物雌激素有关。以往不少研究显示，仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归均有雌激素样作用。逍遥丸、二仙汤对逍遥丸、二仙汤对T47D乳腺癌细胞乳腺癌细胞ER亚型的影响亚型的影响 虽然逍遥丸使大鼠血清E2水平下降、二仙汤血清特异性诱导ER蛋白表达上调，但均未见对ER和ER双阳性的 T47D细胞有明显促进或抑制作用。说明肿瘤细胞的生长也受到多种因素的影响，影响因素及信息通路越多，药物对其产生的效果越复杂多变，所需时间也越长 逍遥丸、二仙汤对逍遥丸、二仙汤对T47D乳腺癌细胞活性的影响乳腺癌细胞活性的影响 结论逍遥丸和二仙汤对机体激素内环境具有调节作用，这种调节是发生在机体当时所处的生理或病理状态基础上的。二仙汤血清对ER有特异性的诱导作用，考虑与其方内所含植物雌激素有关 逍遥丸、二仙汤均未见对乳腺癌T47D细胞有明显促进或抑制作用。临床提示 逍遥丸可降低雌激素水平，提示其用于绝经期前激素敏感型乳腺癌可能与TAM有协同、增效的作用，安全性相对较强；二仙汤可上调ER蛋白表达，可能增加TAM治疗的敏感性，但就目前研究尚无法定论其增加TAM的敏感性还是诱导耐药，尚需进一步研究 二仙汤可提高去卵巢后雌激素水平，故用于治疗乳腺癌患者的更年期综合征或内分泌药物副反应时以及使用芳香化酶抑制剂的绝经期后乳腺癌患者是否安全，尚需进一步研究
