1、微生物应用技术微生物应用技术学习情景三学习情景三 培养微生物、测定其生长培养微生物、测定其生长主要内容主要内容任务任务1 1 测定微生物生长测定微生物生长 任务任务2 理化因素对微生物生理化因素对微生物生长的影响长的影响1 12 2任务任务3 微生物的分离和纯培微生物的分离和纯培养技术养技术3 3学习情景三学习情景三 培养微生物、测定其生长培养微生物、测定其生长（1）微生物纯种分离、培养和常用的接种技）微生物纯种分离、培养和常用的接种技术以及菌落的初步鉴定；术以及菌落的初步鉴定；（2）生长曲线，生长的测量方法，环境对微）生长曲线，生长的测量方法，环境对微生物生长的影响等；生物生长的影响等；（3
2、）理化因素对微生物生长的影响。）理化因素对微生物生长的影响。【学习内容】学习情景三学习情景三 培养微生物、测定其生长培养微生物、测定其生长 掌握微生物纯种分离、培养和常用的接种技术以及菌落的掌握微生物纯种分离、培养和常用的接种技术以及菌落的初步鉴定；掌握生长曲线和生长的测量方法；掌握理化因素初步鉴定；掌握生长曲线和生长的测量方法；掌握理化因素对微生物生长的影响。对微生物生长的影响。【知识目标知识目标】【技能目标技能目标】根据菌种需要，配制不同类型的培养基；完成菌种的根据菌种需要，配制不同类型的培养基；完成菌种的纯化及测量等操作过程。纯化及测量等操作过程。任务任务1 测定微生物生长测定微生物生长
3、学习情景三学习情景三 培养微生物、测定其生长培养微生物、测定其生长 为了全面对微生物的测量，需要了解为了全面对微生物的测量，需要了解微生物生长曲线的相关内容。微生物生长曲线的相关内容。任务分析任务分析任务任务1 1 测定微生物生长测定微生物生长 无论在自然条件下还是在人工条件无论在自然条件下还是在人工条件下，微生物作用的发挥，都是下，微生物作用的发挥，都是“以数取以数取胜胜”或是或是“以量取胜以量取胜”。生长、繁殖就。生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提是保证微生物获得巨大数量的必要前提。任务提出任务提出任务任务1 1 测定微生物生长测定微生物生长一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖
4、任务实施的相关专业知识任务实施的相关专业知识任务任务1 1 测定微生物生长测定微生物生长 个体生长个体生长细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程积扩大的生物学过程。群体生长：群体生长：在一定时间和条件下细胞数量的增加。在一定时间和条件下细胞数量的增加。繁殖繁殖微生物生长到一定阶段由于细胞结构的复制与重建微生物生长到一定阶段由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。加的生物学过程。提问：提问：为什么这里不考察细菌个体的生长呢？为什么这里
5、不考察细菌个体的生长呢？个体太小，难观察计量个体太小，难观察计量;群体细菌对环境产生影响群体细菌对环境产生影响任务实施的相关专业知识任务实施的相关专业知识一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖 各类细菌都是倾向于各类细菌都是倾向于群居（物以类聚）群居（物以类聚）n生存状况提高，攻防具佳生存状况提高，攻防具佳n（攻）（攻）群居的细菌获得营养的能力大大高于游群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，离的细菌，（防）（防）群居的细菌不易被天敌伤害，群居的细菌不易被天敌伤害，还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，可有性生殖；适应环境的变化，可有
6、性生殖；n团结就是力量团结就是力量一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖 细菌群体力量改变环境 通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的菌群体的生长规律生长规律“生、老、病、死生、老、病、死”。一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法1.测生长量测生长量（1）测体积）测体积 初步比较。初步比较。把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察其体积等。进行一定时间的离心，然后观察其体积等。一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖（2）称重法）
7、称重法 方法方法：离心法或过滤法，测定样品的湿重或干重。：离心法或过滤法，测定样品的湿重或干重。已知已知单个细菌的平均重量单个细菌的平均重量 除法计算除法计算 细菌的细菌的湿湿重量重量10-1510-11g/个细胞个细胞 干重约为干重约为湿重的湿重的1020。干重法干重法（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法1.测生长量测生长量 悬浮物无机物悬浮物无机物+有机物（包括细菌）有机物（包括细菌）提问：提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？高温高温(550)灼烧灼烧 一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖1.测生长量测生长量（2）称重法）称
8、重法悬浮物中绝大多数为细菌时 细胞数目细胞数目=MLSS个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量离心沉淀离心沉淀 滤膜过滤滤膜过滤计算计算105110下进行干燥下进行干燥称重称重（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法除细菌外还有大量无机悬浮物时 W无无 MLVSS挥发性悬浮物挥发性悬浮物MLSS W无=细菌群体的干重量细菌群体的干重量 细胞数目细胞数目=MLVSS个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量 550下灼烧下灼烧2h称重称重105110下进下进行干燥恒重行干燥恒重称重称重（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（3）有大量非细菌有机悬浮物时
9、提问：提问：如何测定呢？如何测定呢？不能用重量法，应改用其他方法。不能用重量法，应改用其他方法。总体来说总体来说重量法重量法方法方法误差较大误差较大，一般只作为菌数，一般只作为菌数粗略估算粗略估算 如如活性污泥测定（活性污泥测定（以重量以重量MLSS、MLVSS间接间接表示细菌数量表示细菌数量）（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 （3）比浊计数法）比浊计数法 浊浊细菌悬浮液的浊度细菌悬浮液的浊度原理原理：菌体的生长可使培养液产生浑浊现象。：菌体的生长可使培养液产生浑浊现象。方法方法：用比浊计、比色计、分光光度计测定培养液的浊用比浊计、比色计、分光光度计测定培养液的浊度
10、，用透光率或光密度表示菌悬液的浓度，再对照标准曲线度，用透光率或光密度表示菌悬液的浓度，再对照标准曲线，即可求出菌数。，即可求出菌数。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 (2)(2)比浊法比浊法（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 制标准曲线（ODNo）测菌液浊度，查图表得出细菌数量测菌液浊度，查图表得出细菌数量 分光光度法测分光光度法测 浊度浊度 1 2 3 4其他细菌计数法其他细菌计数法 细菌数量细菌数量 10 100 1000 10000 个个/mL 细菌数量细菌数量 制标准曲线制标准曲线 菌液浊度菌液浊度（一）微生物生长繁殖的测定方法（
11、一）微生物生长繁殖的测定方法仪器：仪器：浊度计、分光光度计等浊度计、分光光度计等仪器测出菌液的浓度，然后再仪器测出菌液的浓度，然后再对照标准曲线，就可查出相似对照标准曲线，就可查出相似的菌数。的菌数。注意注意:培养液的颜色太深会影培养液的颜色太深会影响测定结果，不要混杂其他物响测定结果，不要混杂其他物质。质。适用范围：适用范围：用于溶液的总细胞用于溶液的总细胞的计数。的计数。缺点：灵敏度较差缺点：灵敏度较差优点：简便、快速、不干扰或优点：简便、快速、不干扰或不破坏样品。不破坏样品。浊度计浊度计分光光度计分光光度计（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（4）含含N测定法测定
12、法 原理：原理：细胞蛋白质量是比较稳定的，可反映微生物的生长细胞蛋白质量是比较稳定的，可反映微生物的生长量。通过菌体含氮量的测定求出蛋白质的含量，并大致算量。通过菌体含氮量的测定求出蛋白质的含量，并大致算出细胞物质的重量。出细胞物质的重量。方法：方法：从一定量培养物中分离出菌体，洗涤后用从一定量培养物中分离出菌体，洗涤后用凯氏微量定凯氏微量定氮法氮法测定出总氮含量，其值乘以测定出总氮含量，其值乘以6.256.25，大多数生物包括细菌，细胞内的大多数生物包括细菌，细胞内的蛋蛋 白质氮含量白质氮含量比较稳定，一般为蛋比较稳定，一般为蛋 白质干重白质干重1516，平均为平均为16。（一）微生物生长繁
13、殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数计繁殖数 提问：提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖繁殖 提问：提问：细菌繁殖的可见现象是什么？细菌繁殖的可见现象是什么？产生菌落产生菌落（固体培养基培养）（固体培养基培养）、菌液混浊菌液混浊（液体培养基培养）液体培养基培养）计数原理计数原理：一个一个细菌细菌可繁殖成可繁殖成一个一个菌落或一群细菌菌落或一群细菌.缺点：缺点：慢慢 分分固体培养法和液体培养法固体培养法和液体培养法（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数计繁殖数 计算微生物的个体数
14、目。适宜于单细胞状态的计算微生物的个体数目。适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。微生物或丝状微生物所产生的孢子。（1）显微镜直接计数法）显微镜直接计数法 又称为全菌计数法，又称为全菌计数法，借助显微镜观察测定借助显微镜观察测定（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖（1）显微镜直接计数法）显微镜直接计数法计数器(血球计数板）测定法 菌液滴 染色（或不染色）面积 1cm2 血球计数板1625格或25*16格（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法提问：提问：数了数了125个小格中有个小格中有90个细菌，样品
15、中的细菌浓度是个细菌，样品中的细菌浓度是多少？多少？(90个个125)400/0.1ml=2880个个/ml适用范围：适用范围：细菌个体细菌个体若若太小、过多，由于每一小格中细菌层层太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数一般数125个小格个小格），），折算折算样品细菌浓度；样品细菌浓度；（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 2.计繁殖数计繁殖数 (2)(2)平板菌落计数法平板菌落计数法 通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间通过测定样
16、品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法。接确定其活菌数的方法。依据：依据：在稀释情况下一个菌落是由一个活细胞在稀释情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的。繁殖形成的。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法n（2）平板计数法 1mL 混合混合 1mL 混合混合 9mL 10mL 1 ：10-1 10-1 ：10-2 10-2 10-3 10-4 10-5得到不同得到不同稀释度稀释度 （10-x）菌液菌液 10-2 10-3 10-4 10-5 各取各取1ml于培养皿上于培养皿上,再再加入不烫手固体培养基加
17、入不烫手固体培养基平板上混合均匀冷却。平板上混合均匀冷却。第三步：培养第三步：培养第二步：接种平板第二步：接种平板一微生物的生长繁殖一微生物的生长繁殖 一般计数平板的细菌生长菌落数以一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为个为宜。宜。n细菌数量细菌数量=？n细菌数量细菌数量=数出的菌落数数出的菌落数/稀释度稀释度n例如：例如：10-5稀释度时菌落数为稀释度时菌落数为125cfun细菌数量细菌数量=125/10-5=1.25107cfu/mLn 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法平板计数法是采用最广的一种活菌计数法n如国标法水中如国标法水中细菌总数细菌总数的测定的测定 。n注意注意：作空白
18、及取平行样（作空白及取平行样（2 23 3组）均值减小误差组）均值减小误差（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（3）膜过滤法）膜过滤法方法：方法：用微孔薄膜过滤定量的空气或水样，菌体用微孔薄膜过滤定量的空气或水样，菌体便被截留在滤膜上，然后取下滤膜进行培养，便被截留在滤膜上，然后取下滤膜进行培养，计数其上的菌落数从而求出样品中所含的菌数计数其上的菌落数从而求出样品中所含的菌数。适用范围适用范围：对于细胞总数对于细胞总数10106 6个个/ml/ml的液体样品。的液体样品。对膜干燥后，染色、计数对膜干燥后，染色、计数（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定
19、方法（3 3）薄膜计数法）薄膜计数法 薄膜薄膜微孔滤膜（微孔滤膜（0.45m）滤膜，细菌不能通过 支撑体，支撑滤膜 抽气抽气（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 统计计数统计计数 提问：提问：假如假如 测出测出2 25050cfucfu菌落，抽滤了菌落，抽滤了50ml50ml自来水自来水，自来水中菌浓度是多少呢？，自来水中菌浓度是多少呢？25050ml=5cfu/ml自来水自来水 样品中的细菌数量样品中的细菌数量=菌落数菌落数抽滤样品的体积数抽滤样品的体积数（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法（4 4）稀释培养法）稀释培养法原理原理：菌液经多次稀
20、释后，菌数可随之减少直至没有。：菌液经多次稀释后，菌数可随之减少直至没有。可从最后有菌生长的几个稀释度的可从最后有菌生长的几个稀释度的3 35 5次重复中求次重复中求最大概率数。最大概率数。所以又叫所以又叫MPN(MPN(最大可能数量最大可能数量)法。法。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法 （4）最近似法）最近似法 特点：特点：液体培养、统计学查表计数液体培养、统计学查表计数 又称又称MPN法法（或最可能数法）（或最可能数法）例如例如测定测定SRB（硫酸盐还原菌，硫酸盐还原菌，厌氧厌氧）的数量）的数量 提问：提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？能用稀释平板法计数吗？为
21、什么？一般一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧（除非厌氧培养箱）培养箱）n对这类菌可以利用它们生长时产生的对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征硫化亚铁黑色特征进进行行深层隔氧液体培养深层隔氧液体培养，按，按MPNMPN法进行计数。法进行计数。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法适合范围：适合范围：测定土壤微生物中特定生理群的数量和检测定土壤微生物中特定生理群的数量和检测污水、牛奶中特定微生物类群的数量测污水、牛奶中特定微生物类群的数量。（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法浓度浓度长菌管数长菌管数1010-4-40 0MPN=120MPN=120个个/100mL/100mL1010-5-52 21010-6-62 2菌数菌数120120稀释培养法稀释培养法1010-4-41010-5-51010-6-6（一）微生物生长繁殖的测定方法（一）微生物生长繁殖的测定方法
