1、返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 分析化学教研室分析化学教研室 严拯宇严拯宇 返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6小结小结习题及解答习题及解答返回章目录一、概一、概 述述v 高效液相色谱法高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。v
2、简称：简称：HPLC；HRLC；HSLC；UPLC 超高效液相色谱（超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography）v 与经典与经典LCLC相比相比高效高效 高效填料：高效填料：3 35m 5m 高压泵输液高压泵输液 高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器:在线检测在线检测返回章目录一、概一、概 述述分析对象分析对象流动相差别流动相差别GC能气化、热能气化、热稳定性好、且稳定性好、且沸点较低的样沸点较低的样品，占有机物品，占有机物的的20%20%惰性气体惰性气体HPLC不受样品挥不受样品挥发性和热稳定发性和热稳定性的限制，占性的限制，占有机物的有机物的
3、80%80%液体，种类液体，种类较多，选择余较多，选择余地广地广HPLCHPLC与与GCGC区别区别返回章目录一、概一、概 述述 HPLCHPLC仪器示意图仪器示意图返回章目录一、概一、概 述述 HPLCHPLC仪器图仪器图SHIMAZUAGILENTWATERS返回章目录一、概一、概 述述v特点特点 适用范围广适用范围广 高效高效 高速高速 高灵敏度（主要用高灵敏度（主要用UV 510-10g/ml）流动相选择范围宽流动相选择范围宽 柱可以反复使用（可用柱可以反复使用（可用1-2年）年）流动组分易收集流动组分易收集 安全安全返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理
4、2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录二、基本原理二、基本原理v范氏方程（van Deemter equation)：GC：填充柱填充柱 H=A+B/+CHPLC：H=A+CmDB2TDm原因：T；忽略B/返回章目录二、基本原理二、基本原理GCGC和和HPLCHPLC的的H-uH-u图图1 B/1 B/2 C 2 C 3 A 4 HPLC 3 A 4 HPLC的的opt 5 GC5 GC的的opt返回章目录二、基本原理二、基本原理v HPLC：H=A+C A=2d C=Cm+Csmv影响因素影响因素：选球
5、形固定相，高压、匀浆装柱法d d选粒径小的化学键合相CC选粘度小、低流速的流动相msmmDdpCC2mDdpC2TDm范氏方程范氏方程（van Deemter equation)返回章目录 二、分离度及影响因素：又可：又可：讨论如何由n、k 来改变R2/2112WWttRRR22114kknR返回章目录 1、kk，R R，k k最适宜范围最适宜范围1k51k5 2、改变变峰间距 ，RR在在GCGC主要通过改变固定相主要通过改变固定相（载量一定），而在载量一定），而在HPLCHPLC中，主要通过改变中，主要通过改变流动相。流动相。返回章目录 3、改变n、a a、减小颗粒直径、减小颗粒直径d d
6、b b、提高装柱技术（均匀）、提高装柱技术（均匀）c c、流动相、流动相（低粘度流动相可以增大低粘度流动相可以增大D Dm m）d d、线速度、线速度（减小传质阻抗引起（减小传质阻抗引起H H）e e、增加柱长、增加柱长L L（但太长，柱压大，寿命短）（但太长，柱压大，寿命短）返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（液固吸附色谱法（LSCLSC）1 1液液分配色谱法（液液分配色谱法
7、（LLCLLC）2 2化学键合相色谱法（化学键合相色谱法（BPCBPC）3 3返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法v 液固吸附色谱法液固吸附色谱法 分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心 影响k的因素：与硅胶亲和力大的溶质k大，tR大控制溶剂的极性，可调整tR(常用多元体系流动相)溶剂的极性愈大，洗脱力愈强，k.tR)返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法v液液分配色谱法液液分配色谱法 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 分类分类:反相色谱反相色谱RPLCRPLC固定液极性固定液极性 流动相极性流动相
8、极性返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法v液液分配色谱法液液分配色谱法 固定相固定相：载体可用色谱中的吸附剂；色谱中的固定液都可采用 （常用的有角鲨烷、十八烷等）流动相流动相：反相色谱反相色谱RPLCRPLC流动相极性增大，增大，流动相极性增大，增大，t tR R大大极性大的组分先出柱，极性小的组分极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱后出柱正相色谱正相色谱NPLCNPLC流动相极性增大，减少，流动相极性增大，减少，t tR R小小极性小的组分先出柱，极性大的组分极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法
9、化学键合相色谱法(chemical bonded phase chromatography,BPC)(chemical bonded phase chromatography,BPC)通过化学反应将固定液有机分子通过化学反应将固定液有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂。键合在载体表面所形成的柱填充剂。反相键合相反相键合相离子抑制离子抑制正相键合相正相键合相离子对离子对返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法1.反相键合相色谱法反相键合相色谱法(RBPC)(RBPC)固定相：非极性的键合相固定相：非极性的键合相如如:十八烷基硅烷键合相（十八烷基硅烷键合相（ODSODS；C C18
10、18柱柱)固定相的最佳使用：固定相的最佳使用：流动相：极性大的流动相流动相：极性大的流动相如如:甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水水流动相极性与流动相极性与k k的关系的关系:极性极性，洗脱能力，洗脱能力，kk，组分，组分t tR R极性大的组分先出柱极性大的组分先出柱应用：非极性应用：非极性-中等极性组分，应用范围最广。中等极性组分，应用范围最广。返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法2.正相键合相色谱法正相键合相色谱法(NBPC)(NBPC)固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂极性调
11、节剂 流动相极性与流动相极性与k k的关系的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分t tR R，k k结构相近组分，极性大的组分后出柱结构相近组分，极性大的组分后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法3.离子对色谱法离子对色谱法(IPC,PIC)(IPC,PIC)分离机制分离机制：把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的离：把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的离子在流动相中与离子对试剂（反离子）生成不带电荷的中子在流动相中与离子对试剂（反离子）生成不带电荷的中性离子时，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配性离子时，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使
12、分配系数增大，而改变分离效果。系数增大，而改变分离效果。流动相流动相 固定相固定相 B+H+BH+RSO3Na RSO-3+Na+BH+.RSO-3 BH+.RSO-3 中性离子对中性离子对 增加了在非极性固定相中溶解度。增加了在非极性固定相中溶解度。机理：机理：返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象分析对象离子对试剂离子对试剂例如例如碱碱烷基磺酸钠烷基磺酸钠C C5 5、C C6 6、C C7 7、C C8 8磺酸钠磺酸钠,SDS,SDS酸酸四丁基季胺盐四丁基季胺盐四丁基胺磷酸盐四丁基胺磷酸盐（TBATBA）返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效
13、液相色谱法4.离子抑制色谱法离子抑制色谱法(ISC)(ISC)分离机制分离机制：通过调节流动相的：通过调节流动相的pHpH，抑制组分离解，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的弱碱的目的适用范围：适用范围：3.0pKa7.0 3.0pKa7.0 的弱酸的弱酸 7.0pKa8.0 7.0pKa8.0 的弱碱的弱碱抑制剂抑制剂:弱酸（弱酸（HAcHAc）、弱碱（）、弱碱（NHNH3 3H H2 2O O）或缓冲液）或缓冲液返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法4.离子抑制色谱法离子抑制色谱法(ISC)(I
14、SC)影响的因素：影响的因素：与凡在反相色谱中的影响因素，此处同样影响。pH的影响弱酸：pHpKa时，k,tR减少 (以离子形式，流动相中多)弱碱与上恰相反。pHpKb tR 总之，pH应在28，超出将会腐蚀仪器，流路系统。返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录四、固定相四、固定相v 液液-固色谱固定相固色谱固定相 硅胶硅胶 特点特点 表面多孔硅胶表面多孔硅胶(YBK)YBK)易装柱，柱效不高，柱容量小易装柱，柱效不高，柱容量小 无定形全多孔硅胶（无定形全多
15、孔硅胶（YWGYWG）柱效高，柱容量大，价廉，柱效高，柱容量大，价廉，但硅胶要匀浆）但硅胶要匀浆）球形全多孔硅胶（球形全多孔硅胶（YQGYQG）具具YWGYWG的优，具涡流扩散小，的优，具涡流扩散小，渗透性好渗透性好 堆积硅珠堆积硅珠 传质阻抗小，柱容量大传质阻抗小，柱容量大 返回章目录四、固定相四、固定相v液液-固色谱固定相固色谱固定相 高分子多孔小球高分子多孔小球：YSG （柱效低103）又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。用途：用途：分离芳烃、杂环、甾体、生物碱分离芳烃、杂环、甾体、生物碱返回章目录四、固定相四、固定相v 化学键合相化学键合相特点特
16、点：不易流失不易流失;热稳定性好热稳定性好;化学性能稳定化学性能稳定 载样量大载样量大;适于梯度洗脱适于梯度洗脱分类分类:非极性键合相：非极性键合相：ODSODS中等极性键合相：醚基键合相中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相 返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录五、流动相五、流动相v 要求：要求：与固定液不反应与固定液不反应;对样品有良好溶解度对样品有良好溶解度 粘度小粘度小;与检测器匹配与检测器匹配22114
17、kknR 溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的R R不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，t tR R改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的R R。返回章目录五、流动相五、流动相v 洗脱方式洗脱方式:等度洗脱(isocratic elution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradient elution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例优点：简便，柱易再生；优点：简便，柱易再生；缺点：不能用于复杂组分的分离缺点：不能用于复杂组分的分离 优点：
18、缩短分析周期；提高分离能力；改善峰形；优点：缩短分析周期；提高分离能力；改善峰形；增加灵敏度增加灵敏度缺点：基线漂移缺点：基线漂移返回章目录五、流动相五、流动相 返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站高效液相色谱仪高效液相色谱仪HPLC返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v 输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站 泵：恒压泵恒流泵:
19、柱塞往复泵返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v 输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站六通阀：六通阀：优势：优势：进样量准进样量准确，重现确，重现性好，可性好，可带压进样。带压进样。返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v 输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站 色谱柱：由柱管色谱柱：由柱管(不锈钢管不锈钢管)和固定相组成和固定相组成 分析柱分析柱2-4.6mm L10-25cm 常量柱常量柱1-1.5mm L10-20cm 常微量柱常微量柱 制备柱制备柱20-50mm L3-25cm 返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱
20、仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站检测器检测器:1.1.紫外检测器紫外检测器2.2.荧光检测器荧光检测器3.3.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器4.4.其它检测器其它检测器返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站检测器检测器:1.1.紫外检测器紫外检测器 优点：灵敏度高，精密度、线性范围好，可优点：灵敏度高，精密度、线性范围好，可 用于梯度洗脱。用于梯度洗脱。缺点：缺点：样品组分应吸收紫外光；要考虑溶剂的极限波长。样品组分应吸收紫外光；要考虑溶剂的极限波长。返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相
21、色谱仪v 输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪T/min波长波长(nm)色谱光谱图色谱光谱图返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站检测器检测器:2.2.荧光检测器荧光检测器 优点：灵敏度比紫外更高。检测限优点：灵敏度比紫外更高。检测限1 11010-10-10g/mlg/ml 缺点：只能用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质缺点：只能用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v 输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测
22、器检测器工作站工作站2489UVD2489UVD2414RID2414RID2424ELSD2424ELSD2465ECD2465ECDWATERSWATERSWATERSWATERS返回章目录第七节 定性、定量分析 一、定性分析：1、tR:12 相对保留值=2、化学鉴定：对：对HPLCHPLC流出组分收集，用专属性化学反应对收集流出组分收集，用专属性化学反应对收集 的分离物质组分进行定性。的分离物质组分进行定性。3、联机技术：HPLCHPLCMSMS、HPLCHPLCFTIRFTIR 质谱质谱 富利叶转换红外光谱富利叶转换红外光谱2121KKttRR第七节第七节 定性、定量分析定性、定量分析
23、返回章目录 1、外标法：以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。（1）工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液(Ci)s，准确进样，测量峰面积(Ai)s或峰高(hi)s，与(Ci)s绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程，计算样品溶液的含量。（2）外标一点法：（与气相同）sisiiimAAm)()(二、定量分析：与气相色谱同。二、定量分析：与气相色谱同。返回章目录 2 2、内标法：内标选择同气相。、内标法：内标选择同气相。（1 1）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同量的内标物、进样，分别测出标准物与内标物的量的内标
24、物、进样，分别测出标准物与内标物的A A或或h h，以，以Ai/As(Ci)sAi/As(Ci)s作图。作图。（2 2）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加入同体积样品中，分别进样。入同体积样品中，分别进样。（C Ci i%）样品样品=样品样品样品%)()/()/(isisSiCAAAA返回章目录 3 3、校正因子法：、校正因子法：第一步：精称被测组分的标准品第一步：精称被测组分的标准品m mi ig g，加一定精称，加一定精称L L内标
25、内标M Ms sg g配液进配液进样。由二者峰面积比求出样。由二者峰面积比求出f f；再用待测组分的峰面积与样正因子计算含；再用待测组分的峰面积与样正因子计算含量。令量。令f fs s=1=1 第二步：称一定量样品，加入与测校正因子时相同量的内标物，第二步：称一定量样品，加入与测校正因子时相同量的内标物，配液、进样，测出配液、进样，测出Ai/AsAi/As。式中式中m m称样量称样量 注：用校正因子法时，实验条件必须稳定、波长应重现性好。注：用校正因子法时，实验条件必须稳定、波长应重现性好。ssiiiAmAmf/%100%2mmfAfACsssii返回章目录小结熟悉熟悉掌握掌握了解了解HPLC
26、的特点.HPLC的仪器结构及各部件.HPLC中色谱条件的选择.化学键合相色谱法.范氏方程在HPLC的表达形式.分离度影响因素正相色谱和反相色谱.作业：作业：P453 1、2、3、4返回章目录习题及解答习题及解答反相色谱中固定相的极性 流动相的极性.HPLC中范氏方程的表达式为:.HPLC流动相的pH值应控制为 .小于小于H=A+C2-8返回章目录习题及解答习题及解答计算题：计算题：1.用用15 cm长的长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条柱分离两个组分，已知在实验条件下柱效件下柱效 n=2.84104 m-1，用苯磺酸溶液测得死时间，用苯磺酸溶液测得死时间 t0=1.31 min，测得，测得tR1=4.10 min及及tR2=4.38 min。求：（求：（1）k1、k2、R；（2）若增加柱长至）若增加柱长至30cm，分离度可否达到，分离度可否达到1.5？返回章目录习题及解答习题及解答解：（解：（1）同理：同理：24.381.312.341.31k212.341.102.13kk2211.041knRk（2）211222RLRL2221.00.150.30R21.4R13.231.131.110.4000111tttttkRR返回章目录分析化学教研室：严拯宇分析化学教研室：严拯宇
