1、一、动物细胞制药概述（1）发现细胞和细胞学说创立。）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理学家年英国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。细胞的细胞壁。（2）组织培养或细胞培养。）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养年德国生理盐水培养鸡胚组织，至鸡胚组织，至1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。代。（3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导使其为人类服务的时代，包括真核
2、细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。（4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。动物细胞的形态和特点一、动物细胞的形态二、动物细胞的生理特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）形态
3、分化在离体培养同样也存在。离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型（anchorage-dependent）和非贴壁依赖型（anchorage-independent），前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。动物细胞结构图一、动物细胞的形态1、贴壁细胞这类细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。细胞在该表面生长一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。一、动物细胞的形态2、悬浮细胞、
4、悬浮细胞这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。细胞等，细胞呈圆形。3、兼性贴壁细胞、兼性贴壁细胞兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如胞，如CHO细胞、小鼠细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有态，而当悬浮于培养基中生长时则呈
5、圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。时它们可相互支持贴附在一起生长。二、动物细胞的生理特点1、细胞的分裂周期长一般为1248h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期S 期：DNA的合成，一般为68小时G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为25h。M期：一般持续时间很短，仅0.51h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。二、动物细胞的生理特点2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要
6、一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。二、动物细胞的生理特点3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培
7、养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的50代增加至150代。当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。二、动物细胞的生理特点4、动物细胞对周围环境比较敏感无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。5、动物细胞培养基的要求高与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。二、动物细胞的生理特点6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分
8、泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。动物细胞的培养条件和培养基为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：（1）绝对无菌操作；（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；（3）适量氧气供应；（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等；（6）及时分种，保持合适的细胞密度。动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：
9、一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。书中表5-4是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用场合的列表。尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。常用抗生素及其浓度见表5-5一、动物细胞的培养条件2、水质蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M以上。动物细胞制药用水，要求去热源。一、动物细胞的培养条件3、pHpH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋
10、白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了部分缓冲体系，可以参考。一、动物细胞的培养条件4、渗透压在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表5-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成/gL-1。二、动
11、物细胞培养基的种类和组成细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等，构成这些培养基的主要成分见书中表5-7。二、动物细胞培养基的种类和组成上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等。为了给细胞培养以更大的
12、方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用1020%的胎牛血清。血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。二、动物细胞培养基的种类和组成3、无血清培养基无血清培养基的优点如下：提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞
13、产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。目前已经有市售无血清培养基（书中表5-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：（1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。（2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。（3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还
14、添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。（4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。动物细胞培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。二、动物细胞培养的操作方式无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，其中补料-分批（或流加式）操作在用细菌生产时被普遍采用，但在动物细胞培养中用得较少。其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮
15、培养（suspension culture）适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。2、贴壁培养一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定化生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常出现梯度式不均一现象，故放大受到限制。一、动物细胞大规模培养的方法贴壁培养和悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要
16、用酶将其从基质上消化下来。3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养（1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.0301.045g/ml）、粒径均一，在60250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。一、动物细胞大规模培养的方法3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养（2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合
17、成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种生物反应器进行大规模培养。（3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。二、动物细胞培养的操作方式1、分批式操作一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基（conditioned medium），即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生N
18、amalwa干扰素和疫苗等。二、动物细胞培养的操作方式2、半连续式操作该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。二、动物细胞培养的操作方式3、灌流式操作该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操
19、作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。它的优点是：细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；培养基的比消耗率较短，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。二、动物细胞培养的操作方式灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜
20、培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留反应器中，故采用该操作不存在困难。但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用离心机等。二、植物细胞制药概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人
21、们感兴趣的成分。基本概念1、植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。1、植物组织和细胞培养植物无菌培养技术分如下几类：幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（plant culture）；从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养”（callus culture）；能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”（suspension culture）；离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的
22、培养，称为“器官培养”（organ culture）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培养”（embryo culture）。2、悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。3、细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。4、分生组织培养分生组织培养（meristem culture）又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试
23、验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括12个叶原基。5、外植体外植体（explant）是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成器官形成（organogenesis）一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成（embryo
24、genesis）。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的 单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体”（embryoid，or embryo-like）或“不定胚”（adventitious embryo）。7、无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”（clonal varia
25、nt）。8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体（mutant）。由单细胞形成的无性系称为“单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单细胞变异体”。9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”（subculture），又称“连续培养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。10、次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外
26、，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。植物细胞培养的发展简史19世纪上半页，Schleiden和Schwann提出了细胞学说；20世纪初，德国著名植物学家Haber landt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；20世纪20年代初至30年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。Hanning首次在
27、无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。进展与展望一、诱导子在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。诱导子的作用随诱导子种类的不同而异，如在紫杉醇的细胞工程研究中，Christen等向培养基中加入高压灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或加入硫酸矾和3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。二、前体饲
28、喂前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。生物合成研究结果表明，次级代谢物的形成，依赖于3种主要原材料（结构范围，building block）的供应，即：莽草酸：属芳香化合物，是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；氨基酸：形成生物碱及肽类抗生素类，包括青霉素类和头孢菌素类；乙酸：是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、类异戊二烯等的前体。三、两相法培养两相法培养的基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。该培养方法可以加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。此外，由于产物在固相或疏水液相中的积累简化了下游处理过程。两相法培养系统必须满足如下条件：添加的固相（如树脂）或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成；产物易被固相吸附或被有机相溶解；两相易分离；如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等。
