1、第十七章 动物细胞培养制药工艺动物细胞培养的应用动物细胞培养制药工艺17.1 17.1 制药动物细胞的表达系统与特征制药动物细胞的表达系统与特征17.2 17.2 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建17.3 17.3 动物细胞培养基的制备动物细胞培养基的制备17.4 17.4 动物细胞培养技术动物细胞培养技术17.5 17.5 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制17.117.1制药动物细胞的表达系统与特征制药动物细胞的表达系统与特征一、动物细胞的结构与功能二、制药动物细胞的种类三、生产用细胞系四、动物细胞的生产特征17.117.1制药动物细胞的表达系统与特征制药动物细胞
2、的表达系统与特征 1.动物细胞的结构与功能2、动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前体。葡萄糖限制:通过增加谷氨酰胺消耗得以补偿，反之亦然。葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为TCA循环，彻底氧化产生CO2和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成4、5、7碳糖和NADPH。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。三羧酸循环三羧酸循环2、动物细胞培养的代谢特征谷氨酰胺代谢：脱氨、转氨等，合成其他非必需氨基酸。脱氨作用：生成谷氨酸，脱氨产生的氨，对细胞有毒性。转氨作用：生成嘧啶，嘌呤，
3、氨基糖等合成代谢前体。谷氨酰胺与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。离体动物细胞，转氨是主要代谢途径；Gln是动物细胞的氮源，Gln受限制时，通过增加其他氨基酸的消耗得以补偿。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。l蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体，以 mRNA为模板，进行密码的翻译。3、蛋白质合成，糖基化修饰和分泌表达、蛋白质合成，糖基化修饰和分泌表达动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统蛋白质糖基化修饰糖基化场所：粗糙内质网腔内和高尔基体，加工修饰形成糖基化蛋白质，糖基结构易变化。不同细胞系糖基化特征不同，根据药物的结构，选择适宜细胞系。动物细胞制
4、药动物细胞制药表达系统表达系统糖基化改造是研究热点。糖基化蛋白质分泌分泌泡与细胞膜融合，把产物释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统细胞周期：细胞从分裂开始到分裂结束的一段时间。细胞从分裂开始到分裂结束的一段时间。一个细胞分裂，形成两个细胞。1224h。4、细胞周期与凋亡、细胞周期与凋亡四个阶段：四个阶段：M M期：分裂期，期：分裂期，很短，很短，0.51 h分裂间期分裂间期 G G1 1 S S G G2 2 期。期。G G1 1期：期：DNA DNA 复制前期复制前期,差异大差异大 S S期：期：DNA DNA 合成期，合成期，68 h G G2 2期
5、：期：DNA DNA 复制后期，复制后期，25 h 细胞死死亡的两种方式：两种方式：坏死：坏死：环境因素或病原物入侵，细胞受到严重伤害时环境因素或病原物入侵，细胞受到严重伤害时快速膨胀，染色质凝聚而死亡，细胞直接裂解。快速膨胀，染色质凝聚而死亡，细胞直接裂解。特征是坏死过程不受细胞自主控制。特征是坏死过程不受细胞自主控制。细胞凋亡：细胞凋亡：细胞对环境变化作出的有计划的、执行预细胞对环境变化作出的有计划的、执行预定程序的死亡应答过程。特征是细胞收缩，细胞核和定程序的死亡应答过程。特征是细胞收缩，细胞核和DNADNA断裂，同时被膜包裹形成凋亡小体。断裂，同时被膜包裹形成凋亡小体。4、细胞周期与凋
6、亡、细胞周期与凋亡动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统显微镜下凋亡的细胞形态反应器中的反应器中的死亡形死亡形式主要是凋亡式主要是凋亡不同细胞凋亡发生不同细胞凋亡发生不同不同原因：缺乏生长因原因：缺乏生长因子或血清、营养受子或血清、营养受限和逆境等均可引限和逆境等均可引发凋亡发生。发凋亡发生。细胞培养中需严格细胞培养中需严格控制条件，防止细控制条件，防止细胞凋亡。胞凋亡。动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统 5、制药动物细胞表达系统 5.1 哺乳动物细胞表达系统 5.2 昆虫表达系统基于细胞来源：原代细胞，传代细胞。基于细胞来源：原代细胞，传代细胞。基于细胞寿命：有限细胞系，无限细胞系。
7、基于细胞寿命：有限细胞系，无限细胞系。基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系，异基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。倍体细胞系。基于获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。基于获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。基于生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型基于生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型5.1 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统1、细胞系的分类、细胞系的分类动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养后失去增殖能力，老化死亡。养后失去增殖能力，老化死亡。特点：特点：有限生长（时间）有限生长（时间），有
8、接触抑制性（密度）有接触抑制性（密度）。举例：举例：WI-38 WI-38、MRC-5MRC-5、2BS2BS等用于药品生产，曾经等用于药品生产，曾经广泛应用，但广泛应用，但不是理想的生产细胞系不是理想的生产细胞系。寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数为胞最高培养次数为50506060代。代。胚成纤维细胞：人，胚成纤维细胞：人，5050代；鸡胚，代；鸡胚，3030代；小鼠，代；小鼠，8 8代。代。（1）有限细胞系）有限细胞系动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统概念：概念：细胞在生长基质上分裂增细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇
9、集成片，殖，逐渐汇集成片，当每个细胞当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。胞就停止增殖。特点：特点：保持充足的营养，细胞仍保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，可存活一段时间，但细胞密度不但细胞密度不再增加。再增加。大多数细胞：形成单层细胞，有大多数细胞：形成单层细胞，有少数悬浮培养细胞（癌细胞）：少数悬浮培养细胞（癌细胞）：无无接触接触抑制抑制（2 2）无限细胞系）无限细胞系l概念是寿命和活性不受传代次数影响的细概念是寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可连续培养。胞系，可连续培养。l也称为永久细胞系或连续细胞系。也称为永久细胞系或连续细胞系。l其特
10、点：其特点：永生永生，没有接触抑制现象没有接触抑制现象，对培，对培养条件和营养因子等要求较低，倍增时间养条件和营养因子等要求较低，倍增时间短，短，非常适合于制药工业生产。非常适合于制药工业生产。动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统（3）工程细胞系）工程细胞系l采用基因工程技术对宿主细胞的遗产物质进行了修饰改造，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。l方法：融合或重组NamalwaNamalwa：类淋巴母细胞，悬浮生长。英国：类淋巴母细胞，悬浮生长。英国WellcomeWellcome公司公司SendaiSendai病毒诱导，病毒诱导，大规模生产大规模生产干扰干扰素素，批准上市。产品逐渐淘汰。
11、，批准上市。产品逐渐淘汰。WI-38WI-38：WistarWistar Institute Institute（WIWI），二倍体成纤维），二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感，细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗。第一个被用于制备疫苗。MRC-5MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38WI-38快，对快，对逆境有一定抗性，逆境有一定抗性，用于制备疫苗用于制备疫苗。2、生产用细胞系、生产用细胞系动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统（1 1）人源细胞系）人源细胞系CHOCHO细胞：细胞：Chinese ham
12、ster ovaryChinese hamster ovary特点：贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗特点：贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。透压有较高的忍受能力。最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞。多种。多种衍生突变株，高表达。衍生突变株，高表达。药物：药物：EPOEPO、HBsAgHBsAg、G-CSFG-CSF、凝血因子、凝血因子、DNADNA酶酶I I（2）哺乳动物细胞系）哺乳动物细胞系动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统BHKBHK2121：baby hamster kidneybaby hamster ki
13、dney，成纤维样细胞，成纤维样细胞，用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。上市重组凝血因子。上市重组凝血因子。VeroVero细胞系：非洲绿猴肾的成纤维细胞，多倍体核型，细胞系：非洲绿猴肾的成纤维细胞，多倍体核型，贴壁依赖性。贴壁依赖性。Vero E6Vero E6最为常用，可增殖多种病毒，最为常用，可增殖多种病毒，生生产疫苗。产疫苗。动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统（2）哺乳动物细胞系）哺乳动物细胞系是脾脏是脾脏B B细胞与骨髓瘤细胞的细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞融合细胞特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
14、长，大量分泌和高效表达。易转染和生长，大量分泌和高效表达。应用：应用：抗体药物生产。抗体药物生产。（3）杂交瘤细胞系）杂交瘤细胞系动物细胞制药动物细胞制药表达系统表达系统昆虫杆状病毒科核多角体病毒（载体）携载外源基因，昆虫杆状病毒科核多角体病毒（载体）携载外源基因，感染昆虫细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。感染昆虫细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。19831983：苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统：苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统19841984：家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。：家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。应用：生产抗体、试剂盒等。应用：生产抗体、试剂盒等
15、。日本批准用家蚕系统日本批准用家蚕系统生产生产干扰素已上市。干扰素已上市。常用的昆虫表达系统：常用的昆虫表达系统：Sf21Sf21：来源于秋粘虫的卵巢细胞。容易放大，高效表达。：来源于秋粘虫的卵巢细胞。容易放大，高效表达。Sf9Sf9：从：从SF21SF21中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清培养基的搅拌反应器中生长。培养基的搅拌反应器中生长。TN-5B1-4TN-5B1-4：来源于粉纹夜蛾。表达能力高，能悬浮培养。：来源于粉纹夜蛾。表达能力高，能悬浮培养。5.2 昆虫表达系统昆虫表达系统家蚕完成基因组测序（西南大学完成）家蚕完成基因组测序（西南大学完成
16、）优点：优点：安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDAFDA认可认可易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快。易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快。高量表达：强启动子，外源基因可超量表达；高量表达：强启动子，外源基因可超量表达；高效表达：可容纳较大的外源基因（高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb12kb），表达数个外源基），表达数个外源基因，如抗体，并且装配成有功能的分子。因，如抗体，并且装配成有功能的分子。缺点：缺点：翻译后的加工：翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，但与哺昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，但与哺乳动物细胞不完
17、全相同；乳动物细胞不完全相同；蛋白质合成与加工不匹配，修饰效率蛋白质合成与加工不匹配，修饰效率可能不高，引起溶解性、稳定性、免疫性等变化。可能不高，引起溶解性、稳定性、免疫性等变化。重组率低，筛选困难，周期长，需要重组率低，筛选困难，周期长，需要4 410d10d。2、优点与不足、优点与不足表达系统表达系统对培养条件要求严格对培养基组成要求高天然结构与活性的药物6.动物细胞的生产特征对培养条件要求严格1、温度2、氧气3、pH值 对培养基组成要求高 天然结构与活性的药物 生产工艺特征17.2 17.2 基因工程动物细胞的构建基因工程动物细胞的构建17.2.1 表达载体的设计与构建表达载体的设计与
18、构建17.2.2 转染与培养转染与培养17.2.3 筛选与鉴定筛选与鉴定病毒载体：牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：肿瘤基因治疗 (重组人p53腺病毒注射液；5型腺病毒载体DNA和人p53肿瘤抑制基因重组；术中、术后使用可消灭残留癌)。杆状病毒:外源基因表达（昆虫）。质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞细菌体内扩增，在动物细胞中表达。中表达。选择标记，扩增系统。选择标记，扩增系统。17.2.1 17.2.1 表达载体的设计与构建表达载体的设计与构建1 1、载体类型、载体类型动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建动物病毒启动子动物病毒启动子：SV40SV40早期和晚期启动
19、子、腺病毒早期和晚期启动子、腺病毒晚期启动子、晚期启动子、CMVCMV立即早期基因启动子。立即早期基因启动子。动物基因的启动子动物基因的启动子：高表达，延长因子：高表达，延长因子EF-1EF-1启动启动子、泛素蛋白子、泛素蛋白C C启动子、启动子、IgGIgG启动子。启动子。2 2、启动子与复制子启动子与复制子启动子编码药物基因终止子启动子编码药物基因终止子，选择标记，选择标记动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建终止密码子:T(U)AA,T(U)AG,T(U)GAPolyAPolyA信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗。信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗。常用常用:SV40 SV40
20、 polyApolyA(131(131)、BGHBGH的的polyApolyA(225bp(225bp)。3、终止子、终止子表达载体结构举例表达载体结构举例化学方法：磷酸钙，树脂，化学方法：磷酸钙，树脂，DEAE-DEAE-葡聚糖葡聚糖物理方法：基因枪，显微注射，电击穿孔物理方法：基因枪，显微注射，电击穿孔生物方法：病毒生物方法：病毒17.2.2 转染与培养转染与培养动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建转染：通过病毒载体把外源基因导入哺乳动物转染：通过病毒载体把外源基因导入哺乳动物细胞的技术。细胞的技术。化学转染化学转染动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建动物细胞制药动物细胞制
21、药细胞系构建细胞系构建磷酸钙转染磷酸钙转染电击穿孔电击穿孔物理转染物理转染病毒载体的转染病毒载体的转染l病毒感染细胞病毒感染细胞的过程：的过程：l吸附，脱壳吸附，脱壳l核酸进入核酸进入l进入细胞核进入细胞核l整合整合动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建DNADNA合成途径阻断标记，抗生素抗性标记：合成途径阻断标记，抗生素抗性标记：筛选标记与原理筛选标记与原理动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建选择剂基因作用机理甲氨喋呤dhfr二氢叶酸类似物，竞争性抑制DHFR活性。氨喋呤Tk抑制正常途径dTTP合成5-溴脱氧尿苷Tk阻断dNTP正常合成途径G418,Zeocinneo干扰核糖体
22、，阻断蛋白合成小结与思考题小结与思考题动物细胞培养制药动物细胞培养制药扩增培养：非选择性培养基，扩增培养：非选择性培养基，1-2d1-2d筛选培养：选择性培养基筛选培养：选择性培养基,2-4d,2-4d更换培养基更换培养基，2 23 3周，周，获得单克隆细胞集落。获得单克隆细胞集落。鉴定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定。鉴定。建库：按生物制品要求，建立细胞系和建库，妥善保建库：按生物制品要求，建立细胞系和建库，妥善保存。存。动物细胞制药动物细胞制药细胞系构建细胞系构建3、筛选与鉴定、建库、筛选与鉴定、建库动物细胞培养基制备培养基组成成
23、分培养基种类培养基质量控制动物细胞培养基制备培养基组成成分1、糖类2、氨基酸3、维生素4、无机盐类5、生长类因子与激素动物细胞培养的种类1、天然培养基2、合成培养基血清（Serum）成分与作用血清（Serum）成分与作用血清（Serum）成分与作用2、合成培养3、无血清培养基培养基质量的控制1、培养用水质2、缓冲液Ca,Mg离子具有细胞凝集作用3、生理盐水和平衡盐溶液3、生理盐水和平衡盐溶液4、氨基酸配制5、NaHCO3配制6、培养基灭菌动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞生长和基质依赖性动物细胞培养基本过程动物细胞大规模培养方法动物细胞生长和基质依赖性1、生长基质2、贴壁依赖性细胞3、非
24、贴壁依赖性细胞4、兼性贴壁依赖性细胞动物细胞培养基本过程1、原代细胞培养 过程2、传代细胞培养 过程动物细胞大规模培养方法1、单层贴壁培养 概念与过程1、单层贴壁培养 特点2、悬浮培养3、微载体培养4、固定化培养 90 90年代以来年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的重组细胞的免疫隔离和运载工具免疫隔离和运载工具,利用重组细胞利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病。治疗相关疾病。微囊化人胰岛微囊化人胰岛 培养培养15d15d微囊化小牛肾上腺微囊化小牛肾上腺嗜铬细胞嗜铬细胞 培养培养0d微囊化肝癌细胞微囊化肝癌细胞 培养培养40d40d不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM SEM 照片照片不同放大倍数的壳聚糖不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的海藻酸钠微胶囊的SEM SEM 照片照片重组人红细胞生成素生产工艺重组人红细胞生成素生产工艺概述细胞培养工艺分离纯化工艺 概述1、天然红细胞生成2、EPO的理化性质3、重组人红细胞生成素4、rhEPO的表达研究4、rhEPO的表达研究 CHO培养工艺1、工程CHO细胞系稳定转染的筛选培养2、种子细胞制备3、灌流培养4、培养工艺过程控制 rhEPO的分离纯化工艺1、初级分离2、纯化精制3、EPO的质控与活性检测小 结思考题
