1、免疫原和抗血清制备免疫原和抗血清制备 陈雪丽陈雪丽陈春婉陈春婉 冯慧婷冯慧婷 侯纯蓉侯纯蓉兰州大学兰州大学20102010级医学检验二班级医学检验二班案例一 常州狂犬疫苗造假事件 该公司2008年生产的4个批次人用狂犬疫苗效价低于国家标准，可能导致疫苗接种后免疫抗体水平低，无法充分发挥疫苗应有的预防保护作用，属于不合格产品。什么是疫苗？抗原？抗体？作用？病原微生物及其代谢产物预防疾病用于人工主动免疫的生物制剂人工减毒、灭活、利用基因工程等经过特殊处理的抗原经过特殊处理的抗原疫苗的分类 传统 新型 传统 新型 传统 新型类毒素重组抗原疫苗重组载体疫苗DNA疫苗减毒活疫苗灭活疫苗 亚单位疫苗合成肽
2、疫苗基因工程疫苗免疫原性强的病原微生物，如伤寒、霍乱等，理化方法灭活人工诱导变异或从自然界中筛选的毒力高度减弱的病原微生物用0.3%-0.4%甲醛处理，丧失毒性的外毒素去除有害成分，保留免疫原性成分，脑膜炎球菌荚膜疫苗将具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列与适当载体或佐剂结合成的疫苗采用DNA重组技术制备的只含保护性抗原组分的基因工程疫苗将编码病原体免疫原性的基因插入减毒的病毒或细菌，接种到人体将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原疫苗大致可以分为六大类：灭活疫苗，是被彻底杀死的病原，相当于把反动分子枪毙以后曝尸示众，由于是已经死掉的阶级敌人，往往导
3、致革命队伍警惕性不很高，常需要反复刺激；减毒活疫苗，其实就是可以改造好的黑五类后代，经过教育改造，已经减弱或丧失了危害性，进入人体后现身说法介绍反革命分子的长相，并且可以繁殖供长期围观，效果很好，但也存在突然又反叛的危险，所以在筛选确认时耗费时间极长；类毒素疫苗，是处理后的细菌外毒素，相当于阶级敌人的便便经过消毒后给革命群众作为识别特征；亚单位疫苗，是除去其他成分后提取病原体中有效免疫原所得，如多糖类疫苗等，相当于将谋逆贼子砍头后传首九边以供识别；上述种种，均直接来源于病原，真正像照片的，其实是基因重组疫苗和DNA疫苗，它们都是对病原体照相找到编码免疫原的基因这段基因相当于底片，在基因重组疫苗
4、中，该基因被插入表达系统比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌当中，酵母菌就是冲片机，表达出的抗原相当于冲印好的照片，经过纯化制成疫苗；DNA疫苗则是将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原-相当于上级只发放底片，得自己冲洗。免疫原免疫原疫苗疫苗抗原抗原抗原抗原诱导机体产生免疫应答（免疫原性）诱导机体产生免疫应答（免疫原性）与免疫应答产物结合（抗原性）与免疫应答产物结合（抗原性）疫苗疫苗经过特殊处理经过特殊处理诱导机体产生免疫应答诱导机体产生免疫应答免疫原免疫原诱导机体产生免疫应答诱导机体产生免疫应答抗原抗原半抗原半抗原 仅具有抗原仅具有抗原性性 疫苗
5、都是免疫原？免疫原都是疫苗？免疫原都是抗原？抗原都是免疫原？疫苗疫苗免疫原免疫原抗原抗原合格疫苗？安全性 有效性 专一性 可获得性 适合大批量生产 易保存 经济如何制备？疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：1.筛选种毒；2.扩繁病原；3.处理纯化；4.验证批签。如何制备？颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）灭活疫苗 细胞抗原（绵羊红细胞）经生理盐水等溶液 洗净，配制成一定浓度；细菌抗原 纯菌增菌后处理 制备菌体(O)抗原置于100水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；制备H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛处理；制备细菌毒素抗原，杀菌后用0.5%-1%氯化钙处理。可溶性抗原亚单位疫苗包括：
6、蛋白质、核酸、多糖、脂蛋白等来源：组织和细胞步骤：提取和纯化粗提组织、细胞破碎，取上清 组织匀浆：必须为新鲜或低温保存 高速组织捣碎机法；研磨法（脑、胰腺）2.细胞破碎：冻融法，缓慢融化，适用于细胞 超声破碎法，间歇进行，适用于细胞 酶法，不易破坏内含物成分，适用于微生物 表面活性剂处理法，多用于细菌提取核酸纯化（以蛋白为例）超速离心法 差速离心法 分离大小和密度差异较大的颗粒 差速离心法原理示意图纯化密度梯度离心法将样品放在惰性介质（梯度液）中进行离心沉淀蔗糖、甘油、氯化铯等纯化特点适用于少数大分子抗原及某些比重较小的抗原纯化 选择性沉淀法 盐析法 纯度不高，适合初步纯化，常用33%-35%
7、饱和度的硫酸铵 有机溶剂沉淀法 必须在0下进行，常用乙醇和丙酮 聚合物沉淀法 PEG，分子量越大，PEG浓度越低1.核酸沉淀剂法 硫酸鱼精蛋白、核酸酶等去除核酸纯化 层析法1.凝胶层析法 分子量不同2.离子交换柱层析法 蛋白质的等电点不同3.亲和层析法 生物分子结合的特异性和可逆性纯化-凝胶层析法纯化-凝胶层析法纯化-离子交换层析1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大、纤维素类：分离蛋白质，孔径大纯化-亲和层析纯化 电泳法 分子量电荷数量纯化 粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层
8、析等方法。必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。Going Up纯化抗原的鉴定 含量双缩脲法、比浊法、酚试剂法、直接紫外吸收法等 分子量SDS-PAGE 纯度SDS-PAGE、HPLC 免疫活性双向免疫扩散、ELISA等琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳-模式图SDSSDS是一种阴离子表面是一种阴离子表面活性剂活性剂，能使蛋白质的能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质使各种蛋白质SDSSDS复复合物都带上相同密度的合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的过了蛋白质分子原有的电
9、荷量电荷量蛋白质分子的电泳迁移蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子率主要取决于它的分子量大小量大小人工抗原 人工结合抗原（半抗原）人工合成抗原 基因工程抗原人工结合抗原半抗原半抗原（=20）载体载体(1)蛋白质蛋白质 牛血清蛋白牛血清蛋白多肽类聚合物多肽类聚合物 多聚赖氨酸多聚赖氨酸大分子聚合物大分子聚合物 羧甲基纤维素羧甲基纤维素完全抗原完全抗原物理物理化学化学羧甲基纤维素羧甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮某些功能基团某些功能基团鉴定鉴定吸收光谱分析法吸收光谱分析法放射性核素标记放射性核素标记法法人工合成抗原化学方法化学方法化学方法化学方法合成肽疫苗合成肽疫苗基因工程抗原基因工程疫
10、苗提取、纯化、鉴定提取、纯化、鉴定毒性试验（安全性试验）通常包括杀菌剂的残留，防腐剂的含量，热源含量，有无微生物污染，培养基残留等，例如因为可能有人对鸡蛋过敏，所以所有鸡胚培养的疫苗必须严格监控卵清蛋白残留；而怀疑牛血清中可能有对人体不利的物质，凡添加了牛血清培养细胞的，必须监控牛血清白蛋白残留量；对于灭活疫苗，还要检测其灭活程度，通常是把成品或处理后的原液接种到细胞或实验动物，动物或细胞没有感染迹象才算过关，对于弱毒疫苗，还要用动物做毒力测定，以保证疫苗没有复壮成致病株。效力试验（免疫保护实验）有效性检测，最基本的，是用抗血清检查疫苗中确实含有目的抗原，然后做效力测定，给实验动物注射疫苗，检查有无产生促发特异的免疫应答产生特定抗体，或者，比较倒霉的实验动物会被接种致病菌观察疫苗的保护效应。我的疑问抗原到疫苗，到底要怎么处理？参考：三枪拍案说疫苗生产科学松鼠会蛋白质分离纯化生物秀论坛嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制孙建和、严亚贤等从乙肝疫苗的制备看疫苗纯化技术的发展张国强、赵铠经验概念：1.看书2.wikipedia3.科学松鼠会方法技术：1.文献2.论坛丁香园生物秀小木虫本次课程结束，谢谢大家
