1、章、免疫组织化学技术章、免疫组织化学技术Immunohistochemistry组织胚胎学系李树蕾组织胚胎学系李树蕾2013-11-19概念概念：应用：应用免疫学及组织化学原理免疫学及组织化学原理，对，对组织切片或细胞组织切片或细胞标本标本中的某些多肽和蛋白质等中的某些多肽和蛋白质等大分子物质大分子物质进行进行原位定原位定性、定位或定量性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。免疫细胞化学技术。基本过程基本过程：被检抗原：被检抗原/半抗原提取半抗原提取免疫动物免疫动物特异性特异性抗体抗体标记抗体标记抗体抗原抗体反应部位出现有色沉淀抗原抗体反
2、应部位出现有色沉淀能与对应抗体结合出现抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。脂都属于半抗原。免疫酶组织化学免疫酶组织化学免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学免疫胶体金组织化学免疫胶体金组织化学亲和免疫组织化学亲和免疫组织化学（抗原信号放大系统）优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。第一节第一节 免疫组织化学基本原理免疫组织化学基
3、本原理一、一、直接法直接法 用用酶酶或其它标记物或其它标记物标记的特异性抗体标记的特异性抗体直接与标本中直接与标本中的相应的相应抗原抗原结合，再与结合，再与酶的底物酶的底物作用产生作用产生有色产物有色产物沉积沉积，在抗原抗体反应的部位即可检测。，在抗原抗体反应的部位即可检测。优点：优点：简单快速，简单快速，特异性特异性强，强，非特异性非特异性反应低；反应低；缺点：缺点：敏感性差敏感性差；抗原量要求高；抗原量要求高；很难获得各种市售标记很难获得各种市售标记抗体。（肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白）抗体。（肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白）在免疫荧光和免疫酶技术中因材料处理不当或用量不当产在免疫荧光和免疫酶技
4、术中因材料处理不当或用量不当产生的背景着色反应。生的背景着色反应。第一抗体（第一抗体（兔兔）不标记，使用与）不标记，使用与一抗一抗种属相同抗体种属相同抗体的的FcFc段段（有种属特异性）作为抗原（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），免疫动物（羊），制备抗制备抗抗体，即抗体，即第二抗体（羊抗兔），第二抗体（羊抗兔），并并标记第二抗体标记第二抗体。二、间接法二、间接法染色时，顺次以染色时，顺次以第一抗体第一抗体和和标记的第二抗体标记的第二抗体处理标处理标本，在抗原存在部位形成本，在抗原存在部位形成抗原抗原-第一抗体第一抗体-标记第二标记第二抗体复合物抗体复合物，以达到检测，以达到检测该抗原的目的
5、。该抗原的目的。优点：优点：间接法因第二抗体的放大作用敏感性大间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高（放大原理大增高（放大原理=抗原：抗体抗原：抗体1：6）；缺点：缺点：可能出现非特异性反应；可能出现非特异性反应；子宫内膜巨噬细胞移动抑制因子MIF三、亲和三、亲和免疫组织化学免疫组织化学(一一)亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法法)特点特点:以以亲和素亲和素作为作为“桥桥”将将生物素结合的酶生物素结合的酶和和生物素化的抗生物素化的抗体体连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以
6、增加敏感性。连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。1.1.原理原理:o生物素生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为244.31，pI为为3.5，咪唑酮环（又称，咪唑酮环（又称Ureido环）环）(I环环)是与亲合是与亲合素结合的主要部位；素结合的主要部位；环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构。基是标记抗体和酶的唯一结构。IIIo亲和素亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，分子又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，分子量为量为6.8KD，pI 1010.5；在；在pH9
7、13缓冲液中性质均稳缓冲液中性质均稳定。天然定。天然(卵白卵白)亲合素为碱性蛋白，由亲合素为碱性蛋白，由4个相同的亚单位构个相同的亚单位构成成4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的与生物素中的Ureido环（环（I环）结合。因此，环）结合。因此，1个亲合素分个亲合素分子存在子存在4个与生物素分子结合位点个与生物素分子结合位点 ABC法法亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法ABC法原理法原理2.免疫组织化学酶类标记物免疫组织化学酶类标记物 免疫组化标记物的酶以共价键结合在抗体上，免疫组化标记物的酶以共
8、价键结合在抗体上，ABC法则采用生物素法则采用生物素-亲和素系统，制成酶标抗体，再借亲和素系统，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉淀，助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉淀，在光镜下进行各种抗原成分观察在光镜下进行各种抗原成分观察。常用酶类：辣根过氧化物酶常用酶类：辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP),碱性磷酸酶碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)用于标记的酶的特性用于标记的酶的特性o酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察o酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部酶反应终产物
9、是稳定的沉淀，不会从酶活性部位向四周弥散而影响组织学定位位向四周弥散而影响组织学定位o较易获得纯的酶分子较易获得纯的酶分子o中性中性PH值时，酶分子稳定值时，酶分子稳定o酶连接在抗体上，二者活性均不受影响酶连接在抗体上，二者活性均不受影响HRP底物底物:过氧化物：过氧化氢过氧化物：过氧化氢 供氢体：二氨基联苯胺供氢体：二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)3-氨基氨基-9乙基咔唑乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)DAB+H2O2 棕色；棕色；AEC+H2O2 紫红色紫红色AP磷酸酯水解酶，磷酸酯水解酶，溴氯羟吲哚磷酸盐溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）
10、底物）/硝基蓝四唑硝基蓝四唑(BCIP/NBT)溴氯羟吲哚磷酸盐溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）底物）/硝基硝基四紫唑四紫唑(BCIP/INT)NBT/BCIP 蓝紫色蓝紫色 INT/BCIP 棕红色棕红色或或橘黄色橘黄色 HRPHRPAPAPABC法的法的优点优点：敏感性更高：敏感性更高ABC法的法的缺点缺点：亲和素亲和素(鸡蛋白鸡蛋白)中含有中含有10%糖类，导致背景着色糖类，导致背景着色亲和素的等电点约亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维左右，带较多的负电荷，导致纤维组织着色。组织着色。内源性生物素导致背景着色内源性生物素导致背景着色亲和素中有亲和素中有4个结合点，其中一半与连接抗
11、体结合，另一个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，可降低其敏感性半与复合物结合，可降低其敏感性。(二二)链霉菌抗生物素蛋白链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法过氧化酶法（Streptavidin-peroxidase method，SP法）o 链霉亲和素替代链霉亲和素替代ABC法中的亲和素法中的亲和素-生物素复生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，过氧化酶法，SP法Ag1Ab2AbDABABC methodDABSP methodA-B-ComplexSa-P-ComplexPABPSa放大系统放大系统o链霉亲和素链霉亲和素SA（链霉菌抗生物素
12、蛋白）约（链霉菌抗生物素蛋白）约6.5KD，由，由4条相同肽链构成，每条肽链可结合条相同肽链构成，每条肽链可结合1个生物素分子。每个生物素分子。每个个SA有有4个生物素结合位点，结合常数与个生物素结合位点，结合常数与A相同为相同为1015mol/L，约为抗原抗体间，约为抗原抗体间ka（1051011 mol/L)的的1万倍以上。万倍以上。SA最高的活性可达最高的活性可达18u，较，较A高（高（15u）；）；SA的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合。的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合。o链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快。链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快。o等电点为等电点为5.56.7，
13、接近中性，所带的负电荷少；，接近中性，所带的负电荷少；o链霉亲和素不含糖基。链霉亲和素不含糖基。o敏感性更高，特异性更强。敏感性更高，特异性更强。SP法的优点法的优点第二节、免疫组织化学染色步骤第二节、免疫组织化学染色步骤一、免疫组化染色步骤一、免疫组化染色步骤（一）石蜡切片（一）石蜡切片1.1.烤片：烤片：58 2-58 2-h h；目的：带蜡的组织切片牢固黏在载玻片上目的：带蜡的组织切片牢固黏在载玻片上 注意：高温加速组织中抗原氧化注意：高温加速组织中抗原氧化2.2.脱腊和水化：二甲苯脱腊和水化：二甲苯、中浸泡中浸泡15min15min脱蜡脱蜡100100酒精酒精、中分别浸泡中分别浸泡5m
14、in955min95、9090、8080、7070酒精各浸泡酒精各浸泡2minPBS2minPBS洗洗3 3次次3min,3min,置蒸置蒸馏水中待用；馏水中待用；3.3.抗原修复：甲醛形成醛键、羧甲抗原修复：甲醛形成醛键、羧甲基等封闭部分抗原决定簇；蛋白基等封闭部分抗原决定簇；蛋白分子交联隐蔽了抗原决定簇。分子交联隐蔽了抗原决定簇。加热修复加热修复 ：高压修复：高压修复：pH 6.0pH 6.0的的0.1mol0.1molL L柠柠檬酸缓冲液高压锅内煮沸，切片檬酸缓冲液高压锅内煮沸，切片置于其中置于其中,高压修复高压修复1.5min1.5min，室，室温冷却，蒸馏水和温冷却，蒸馏水和PBSP
15、BS各冲洗各冲洗2 2次次3min3min；注意：时间过长背景加深；新鲜注意：时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量柠檬酸缓冲液；缓冲液足量微波修复：微波修复：pH 6.0pH 6.0的的0.1mol0.1molL L柠檬酸缓冲液微波煮柠檬酸缓冲液微波煮沸，切片置于其中，中高档微波处理沸，切片置于其中，中高档微波处理15-20min15-20min，室，室温冷却，蒸馏水和温冷却，蒸馏水和PBSPBS各冲洗各冲洗2 2次次3min3min；蒸汽修复蒸汽修复:内，盛自来水的铝制容器加热至水沸内，盛自来水的铝制容器加热至水沸腾腾,放入含放入含pH 6.0pH 6.0的的0.1mol0.1mo
16、lL L柠檬酸缓冲液和柠檬酸缓冲液和切片的容器切片的容器.继续沸腾继续沸腾10-15min,10-15min,室温冷却室温冷却.(强强烈推荐烈推荐)胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化：细胞内抗原：细胞内抗原 0.1%0.1%胰酶溶液（胰酶溶液（0.1%0.1%氯化钙氯化钙 pH7.8 pH7.8），），3737，15-30 15-30 minmin，,PBS,PBS冲洗冲洗3 3次次3min3min；胃蛋白酶消化胃蛋白酶消化：细胞间质抗原：细胞间质抗原 0.4%0.4%，3737，30-180 min30-180 min注意注意:酶溶液新鲜配制酶溶液新鲜配制;或分装冻存或分装冻存;要预热要预热建议建议：
17、仔细阅读抗体说明书，是否需要进行抗原修复，选择：仔细阅读抗体说明书，是否需要进行抗原修复，选择合适的抗原修复方法和时间。合适的抗原修复方法和时间。单一方法无效单一方法无效,可联合应用可联合应用,适合于免疫组化双重标记适合于免疫组化双重标记或多重标记或多重标记.4.4.细胞膜打孔细胞膜打孔 0.10.1-0.3-0.3tritonX-100tritonX-100浸泡，浸泡，RTRT，25min25min，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次5min5min 原理原理:tritonX-100:tritonX-100为脂溶性去垢剂为脂溶性去垢剂 注意：检测膜抗原可省略此步骤；石蜡切片和冰冻切片注意：检测膜
18、抗原可省略此步骤；石蜡切片和冰冻切片可以省略此步骤。可以省略此步骤。使抗体渗透进入细胞的方法使抗体渗透进入细胞的方法（1 1）Triton X-100 Triton X-100：使细胞膜脂类溶解：使细胞膜脂类溶解 （2 2）Np-40Np-40：使细胞膜蛋白质破环：使细胞膜蛋白质破环 （3 3）SaponinSaponin皂苷：使细胞膜胆固醇溶解皂苷：使细胞膜胆固醇溶解5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素灭活内源性酶及封闭内源性生物素（1 1）灭活内源性过氧化物酶：灭活内源性过氧化物酶：3 3甲醇甲醇-H-H2 2O O2 2浸泡，浸泡，RTRT，30min30min，PBSPBS冲洗冲洗3 3
19、次次5min5min；（2 2）灭活碱性磷酸酶：以每毫升）灭活碱性磷酸酶：以每毫升24mg24mg左旋咪唑加入底物液左旋咪唑加入底物液中，保持中，保持PH7.6PH7.68.28.2。酸性磷酸酶用。酸性磷酸酶用0.05M0.05M酒石酸抑制。酒石酸抑制。（3 3）灭活内源性生物素：灭活内源性生物素：有些组织有些组织(腺上皮、脑和胚胎组织腺上皮、脑和胚胎组织)内源性生物素含量比内源性生物素含量比较高，特别在使用高温加热修复方法暴露抗原决定簇后，较高，特别在使用高温加热修复方法暴露抗原决定簇后，组织内源性生物素大量暴露，容易造成假阳性。组织内源性生物素大量暴露，容易造成假阳性。内源性生物素阻断试剂
20、盒阻：断剂内源性生物素阻断试剂盒阻：断剂A A液（液（0.01%0.01%亲和素）亲和素）1 1滴，滴，RTRT，10min10min，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次2min2min；加；加B B液（生物素）液（生物素）1 1滴，滴，RTRT，1010分钟，分钟，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次2min2min。6.6.非免疫血清封闭：非免疫血清封闭：原因：富含正电荷的胶原和结缔组织吸附抗体原因：富含正电荷的胶原和结缔组织吸附抗体 目的：吸附带正电荷的蛋白目的：吸附带正电荷的蛋白 操作：与二抗种属相同的非免疫血清或操作：与二抗种属相同的非免疫血清或2-52-5BSABSA（牛血清白蛋白），（牛血
21、清白蛋白），RTRT，10min10min，不洗；，不洗；注意注意：结合不牢固，不能冲洗：结合不牢固，不能冲洗 建议建议：可试用不同动物的非免疫血清（尽量不：可试用不同动物的非免疫血清（尽量不要与一抗种属相同）要与一抗种属相同）7.7.加入一抗加入一抗 44过夜，或过夜，或3737孵育孵育1-2h1-2h，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次5min5min多克隆抗体兔多抗价格低，效价高非特异性反应高，效价不稳定单克隆抗体小鼠单抗大鼠单抗兔单抗特异性强，无交叉反应，效价稳定价格高，效价低浓缩型抗体摸索效价市售抗体稀释液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗体无需摸索效价8.8.加入生物素标记加入生物
22、素标记IgG(IgG(二抗），二抗），RT,10RT,10分钟，分钟，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次5min5min；注意：与一抗匹配注意：与一抗匹配9.9.加入链霉亲和素加入链霉亲和素-生物素生物素-辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶/碱性碱性磷酸酶（磷酸酶（SABC-PODSABC-POD，或，或SABC-APSABC-AP），），RT,10minRT,10min，PBSPBS冲洗冲洗4 4次次5min5min10.10.AEC或或DAB（或或NBT/BCIP）显色显色 显色过程显色过程为为2 210min10min（镜下监控，（镜下监控，AECAEC不能长期保存），不能长期保存），蒸馏水或自来水冲洗；蒸馏水或自来水冲洗；11.AEC11.AEC和和NBT/BCIP显色直接用水溶性封片剂封显色直接用水溶性封片剂封片。片。12.12.苏木精复染（苏木精复染（1010秒钟），自来水冲洗返蓝秒钟），自来水冲洗返蓝13.13.苏木精染色则经过脱水透明，用中性树胶封片。苏木精染色则经过脱水透明，用中性树胶封片。14.14.镜下检查结果镜下检查结果DAB显色ChATChAT免疫组化检测结果免疫组化检测结果AEC显色NoImageProstate Double label Cytokeratin 5(m),AP substrate(blue)CD34(m),AEC（red）
