1、抗体制备技术抗体制备技术第1页，共87页。n 是指无性繁殖细胞系，是由单一个是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。变发生，其基因是完全相同的。克隆克隆(clone)第2页，共87页。1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody,pAb）：用）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体机体多个多个B细胞克隆细胞克隆产生针对产生针对多种抗原表位多种抗原表位的不同的不同
2、抗体。所获得的免疫血清实际上是含有抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的多种抗体的混合物混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAb）：）：由一个由一个识别一种抗原表位识别一种抗原表位的的B细胞克隆产生的同源抗细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。性。第3页，共87页。抗体的制备技术经历了三代抗体的制备技术经历了三代：n第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（体
3、（polyclonal antibody）；）；n第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体抗体(monoclonal antibody,McAb)；n第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。第4页，共87页。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）
4、脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单克单克隆抗隆抗体和体和多克多克隆抗隆抗体产体产生区生区别示别示意图意图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+PEG,融合融合Ab2第5页，共87页。抗体制备技术抗体制备技术n一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备n（一）免疫原的制备（一）免疫原的制备n（二）免疫动物（二）免疫动物n（三）免疫血清的纯化（三）免疫血清的纯化n（四）免疫血清的鉴定（四）免疫血清的鉴定n（五）免疫血清的保存（五）免疫血清的保存n二、单克隆抗体制备二、单克隆抗体制备n（一）单克隆抗体制备原理（一）单克隆抗体制备原理第6页，共87页。抗体制备技术
5、抗体制备技术n（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点n（三）影响杂交瘤技术的因素（三）影响杂交瘤技术的因素n（四）单克隆抗体的应用（四）单克隆抗体的应用n三、基因工程抗体技术三、基因工程抗体技术n（一）人源化抗体（一）人源化抗体n（二）小分子抗体（二）小分子抗体n（三）双特异性抗体（三）双特异性抗体n（四）抗体库技术（四）抗体库技术第7页，共87页。多克隆抗体制备多克隆抗体制备一、免疫原的制备一、免疫原的制备免疫原免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是重要的
6、性质是免疫原性免疫原性（immunogenicity）免疫原免疫原天然抗原、人工天然抗原、人工 合成抗原；合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；第8页，共87页。（一）、细胞性抗原制备：（一）、细胞性抗原制备：绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；溶血素；细菌细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）抗菌抗体（动物免疫血清）（二）、可溶性抗原制备：（二）、可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化要由细胞的破碎、提取与纯化n1）细胞的破碎（物理法、化学法）细胞的破碎（物理法、化学法）第9页，共87
7、页。n反复冻融法反复冻融法n超声破碎法超声破碎法n自溶法自溶法n酶处里法酶处里法n表面活性剂处理法表面活性剂处理法第10页，共87页。n2）提取与纯化：）提取与纯化：超速离心分离超速离心分离是一种根据分离物质的是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。只适宜少数大分子物质的分离。第11页，共87页。选择性沉淀选择性沉淀选择某抗原理化特性，采用相应沉淀选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。剂或溶液环境。核酸去除核酸去除 盐析沉淀法盐析沉淀法 有
8、机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法例：例：50%50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%8%12%PEG600012%PEG6000可沉淀可沉淀IgGIgG。第12页，共87页。n 盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 第13页，共87页。超滤法超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。不同分子大小的抗原物质进行滤筛。层析法层析法 凝胶过滤凝胶过滤 离子交换离子交换 亲和层析亲和层析电泳电泳（略）（略）第14页，共87页。凝胶过滤层析凝胶过滤层析(分子筛分子筛)的作用
9、机理的作用机理第15页，共87页。亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理第16页，共87页。3）鉴定：）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。蛋白的含量蛋白的含量定氮（紫外光定氮（紫外光280nm等）等）分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱蛋白的纯度蛋白的纯度电泳等电泳等免疫学活性免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹免疫双扩散、免疫印迹第17页，共87页。抗原性质分析结果抗原性质分析结果第18页，共87页。（三）半抗原性免疫原的制备（三）半抗原性免疫原的制备1.载体选择载体选择n常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合
10、物。常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤）、羧甲基纤维素维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良
11、好的抗体。导动物产生良好的抗体。第19页，共87页。2.连接方法连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。半抗原与载体的连接有物理法和化学法。n物理法物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有有PVP和和CMC等；等；n化学法化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。应选用不同的方法进行连接。第20页，共87页。根据半抗原拥有的化
12、学基团不同，连接方法根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类：主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗
13、原衍生物后才能与载体连接。的半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。衍生物。第21页，共87页。（五）免疫佐剂（五）免疫佐剂n某些物质与抗原一起或先于抗原注入某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可机体，可增强机体对该抗原的特异性增强机体对该抗原的特异性免疫应答免疫应答或或改变免疫应答类型改变免疫应答类型，此类，此类物质称为免疫佐剂物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。简称佐剂。第22页，共87页。1.佐剂的种类佐剂
14、的种类 佐剂一般包括以下几类：佐剂一般包括以下几类：无机佐剂：无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等如氢氧化铝、明钒等生物性佐剂：生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；胞壁酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂：人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；）；油剂：油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等
15、；纳米佐剂纳米佐剂 第23页，共87页。弗氏佐剂（弗氏佐剂（Freunds adjuvant）,分为分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：n前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温剂（羊毛脂或吐温-80）按）按1：11：5比例比例混合而成；混合而成；n后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成匀，制成“油包水油包水”乳化液。乳化液。第24页，共87页。佐剂与抗原混合乳化的方法：佐剂与抗原混合乳化的方法：n研磨法研
16、磨法n和搅拌混合法两种和搅拌混合法两种 第25页，共87页。2.佐剂的免疫生物学作用佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变型转变为为IgG型；型；引起或增强迟发性超敏反应。引起或增强迟发性超敏反应。第26页，共87页。3.佐剂的作用机制佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种
17、：佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：n可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。强抗原的免疫原性。n佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。于抗原的缓慢释放。n增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，
18、从而增强和扩大免疫应答的效应。增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。第27页，共87页。二、免疫动物 n为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。物的年龄均与免疫效果密切的关系。第28页，共87页。1.免疫动物的选择免疫动物的选择 选择动物时应考虑以下因素：选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源
19、与免疫动抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。绵羊、山羊、马、驴等大动物。抗原性质与动物种类。抗原性质与动物种类。第29页，共87页。
20、2.免疫方法免疫方法 选定动物后，在免疫过程中应考选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。免疫间隔等因素。(1)免疫原的剂量：免疫原的接种剂免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。第30页，共87页。(2)免疫途径与免疫间隔时间免疫途径与免疫间隔时间n免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同
21、的免疫方案而异。对于腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。n免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以1020天为佳，二次后间隔时间一般为天为佳，二次后间隔时间一般为710天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。不高。第31页，共87页。3.动物采血动物采血 采集免疫血清前，要预先测试抗体采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在
22、末效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。价会下降。(1)颈动脉采血法颈动脉采血法 (2)心脏采血法心脏采血法 (3)静脉采血法静脉采血法 第32页，共87页。图图1 颈动脉分离图颈动脉分离图 第33页，共87页。三、免疫血清的纯化三、免疫血清的纯化 1.特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化 免疫原不纯，导致产生杂抗体免疫原不纯，导致产生杂抗体混杂于抗血清中。杂抗体的除去混杂于抗血清中。杂抗体的除去可采用：可采用：(1)亲和层析法亲和层析法（2）吸附法）吸附法 第34页，共87页。2.IgG类抗体的纯化类抗体的纯化 IgG类抗体的纯
23、化常用方法有盐类抗体的纯化常用方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。和层析等方法。(1)盐析法：硫酸铵盐析常用于盐析法：硫酸铵盐析常用于-球球蛋白提取，经三次沉淀后提取的蛋白提取，经三次沉淀后提取的-球球蛋白大多属于蛋白大多属于IgG。第35页，共87页。(2)凝胶过滤法凝胶过滤法：各种蛋白质成分的分子：各种蛋白质成分的分子量大小不同，量大小不同，在通过凝胶介质时，洗脱在通过凝胶介质时，洗脱速度也不同，从而达到分离目的。速度也不同，从而达到分离目的。血清蛋白的分级分离常用凝胶过血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法进行，按分子大小可分为三组：第滤法进行
24、，按分子大小可分为三组：第一组包括一组包括IgM和一些脂蛋白；第二组主和一些脂蛋白；第二组主要是要是IgG和较少量的和较少量的IgA、IgD、IgE等等球蛋白；第三组主要白蛋白、血清粘蛋球蛋白；第三组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等。白、铁传递蛋白等。第36页，共87页。在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图 (M=IgM,G=IgG,A=IgA)第37页，共87页。(3)离子交换层析法纯化离子交换层析法纯化IgGnIgG作为一种作为一种-球蛋白，球蛋白，在血清蛋白中带电荷较最少，在血清蛋白中带电荷较最少，用用离子交换层析法易于分离。离子交换层析法易于分离。D
25、EAE-Sephadex A-50是一弱碱性离子交换剂，常用于免疫球蛋白的纯是一弱碱性离子交换剂，常用于免疫球蛋白的纯化。化。n血清中的血清中的-球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在白。在pH7.27.4的环境中的环境中,酸性蛋白被酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，吸附，-球蛋白不被吸附而得以纯球蛋白不被吸附而得以纯化。该技术纯化化。该技术纯化IgG简便，不损坏抗体结构和特异性。简便，不损坏抗体结构和特异性。第38页，共87页。图图3 在在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图纤维素上人血清蛋白的层析示意图 (M=IgM,G=IgG,A
26、=IgA)第39页，共87页。(4)亲和层析法纯化亲和层析法纯化 葡萄球菌葡萄球菌A蛋白（蛋白（SPA）或连球菌）或连球菌G蛋白具有蛋白具有与与IgG Fc段结合的能力，可用亲和层析来分离段结合的能力，可用亲和层析来分离IgG。分离时可采用两种类型的亲和层析柱即分离时可采用两种类型的亲和层析柱即SPA或或G蛋白交联至蛋白交联至Sepharose 4B制成的亲和层析柱。制成的亲和层析柱。抗血清通过层析柱时，抗血清通过层析柱时，IgG被吸附，而非特异性蛋被吸附，而非特异性蛋白则未能结合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使白则未能结合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使IgG从层析上解离从而达到纯化目的从层
27、析上解离从而达到纯化目的。第40页，共87页。图图4 亲和层析纯化亲和层析纯化IgG基本过程示意图基本过程示意图 第41页，共87页。n四、免疫血清的鉴定四、免疫血清的鉴定1.效价的测定：颗粒性抗原可采用效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、疫扩散试验、ELISA等方法。等方法。2.特异性的鉴定：抗体特异性鉴定特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法常用双向免疫扩散法、免疫电泳法第42页，共87页。3.纯度的鉴定：纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺聚丙酰胺凝胶电泳（凝胶电泳（SDS
28、-PAGE）、双向扩散试验、）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。免疫电泳等方法。IgG含有重链和轻链，纯含有重链和轻链，纯IgG的的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和和22kD），若出现多条电泳带则表），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。4.亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、如平衡透析法、ELISA或或RIA竞争结合试验竞争结合试验等。等。第43页，共87页。n单抗亲合常数的测定单抗亲合常数的测定：n单抗亲合常数测定采用非竞
29、争酶免疫试验法：单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：n1）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；n2）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为值作为OD-100，找出，找出OD-50时的抗体浓度和相应的时的抗体浓度和相应的pp65抗抗原浓度；原浓度；n3)根据公式根据公式Ka=n-1 计算计算McAb的的Ka值。值。n 2(nAbt-Ab t)nt代表测定时的温度；代表测定时的温度；nn=Abt/Abt；nAbt表示抗原浓度较高的表示抗原浓度较高的Amax的一半；的一半；nAbt表示抗原浓度较低的表示抗原浓度较
30、低的Amax的一半。的一半。n对于单克隆抗体，一般亲合力要求对于单克隆抗体，一般亲合力要求107L/mol，好，好的单抗多大于的单抗多大于109 L/mol。第44页，共87页。五、免疫血清的保存五、免疫血清的保存 1、4保存（保存（6个月）个月）2、低温保存（、低温保存（-70 -20 ，5年）年）3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 10年）年）注意点：保存前需经除菌注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）避免反复冻融（分装）第45页，共87页。第二节第二节 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 Preparation of monoclone antibod
31、y第46页，共87页。单克隆抗体（单克隆抗体（McAbMcAb）是由只识别单一抗原决定簇的是由只识别单一抗原决定簇的B B细胞克细胞克隆产生的同源抗体。隆产生的同源抗体。理化性状高度均一理化性状高度均一 效价高效价高 只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一 具有高度特异性又易于大量制备具有高度特异性又易于大量制备第47页，共87页。克隆选择学说的模式图克隆选择学说的模式图第48页，共87页。单克隆抗体制备方法：单克隆抗体制备方法：n杂交瘤技术杂交瘤技术nEBV技术技术第49页，共87页。杂交瘤单克隆抗体杂交瘤单克隆抗体?n通过抗原致敏通过抗原致敏B淋巴细胞
32、和骨髓瘤细胞融合形成淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克隆杂交瘤杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克隆杂交瘤细胞克隆，所分泌的针对抗原上某一抗原表位的细胞克隆，所分泌的针对抗原上某一抗原表位的纯的抗体，具有生物活性单一，理化性质高度均纯的抗体，具有生物活性单一，理化性质高度均一，产量高等特点。一，产量高等特点。第50页，共87页。一、杂交瘤技术的基本原一、杂交瘤技术的基本原理理第51页，共87页。一、一、杂交瘤技术的原理及流程杂交瘤技术的原理及流程第52页，共87页。第53页，共87页。第54页，共87页。二、单克隆抗体制备技术二、单克隆抗体制备技术1.主要材料主要材料
33、2.细胞融合前准备细胞融合前准备3.细胞融合细胞融合 4.抗体的初筛和克隆化抗体的初筛和克隆化5.杂交瘤细胞冻存与复苏杂交瘤细胞冻存与复苏6.单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的批量生产7.单克隆抗体的纯化与鉴定单克隆抗体的纯化与鉴定第55页，共87页。（一）主要材料：（一）主要材料：1.RPM1640培养液培养液 FCS 10%谷氨酰胺谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素青霉素 100IU/ml 链霉素链霉素 100Ug/ml2.DMEM培养液培养液第56页，共87页。H H（Hypoxanthine,HHypoxanthine,H）次黄嘌呤；）次黄嘌呤；A A（AminopterinAminopt
34、erin）氨基喋呤；）氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断叶酸拮抗物，阻断DNADNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine,T)T(Thymidine,T)胸腺嘧啶核苷；胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径，供细胞通过替代途径合成合成DNADNA。第57页，共87页。淋巴细胞：在培养液中不能生长，5-7天死亡；骨髓瘤细胞：在培养液中不能生长，5-7天死亡；DNA合成的主要途径：被A阻断；DNA合成的替代途径：由于HGPRT缺乏，不能利用 H、T而被阻断。HATHAT选择作用选择作用第58页，共87页。PEG是最常用的细胞融合剂。PEG可能的作用机理：PEG导致细胞膜上脂
35、类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合。PEG的细胞融合作用完全是随机发生的。一般选用分子量4000 的PEG作为细胞融合剂。不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同。细胞融合剂细胞融合剂第59页，共87页。（二）细胞融合前准备（二）细胞融合前准备 1.免疫方案免疫方案 颗粒性抗原颗粒性抗原 可溶性抗原可溶性抗原 2.饲养细胞饲养细胞 3.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 4.免疫脾细胞免疫脾细胞第60页，共87页。常用骨髓瘤细胞系有：常用骨髓瘤细胞系有：NS1SP20X63 Ag8.653 第61页，共87页。第62页，共87页。骨髓瘤细胞系选择要点：骨髓瘤细胞系选择要点：n动物品系
36、相同动物品系相同n不产生免疫球蛋白重链和轻链不产生免疫球蛋白重链和轻链n对对HAT敏感敏感n融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞第63页，共87页。1 选择对数生长期的细胞进行传代培养，细胞形态应是浑圆、透亮、均一、排列整齐。2 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞。切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80或液氮及干冰中。第64页，共87页。1.细胞融合细胞融合 2.HAT2.HAT选择杂交瘤选择杂交瘤(二二)细胞融合，选择杂交瘤细胞融合，选择杂交瘤第65页，共87页。（三）抗体初筛与克隆化三）抗体初筛与克隆化以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。以快速、简便、特异、
37、敏感的方法为原则。常用的方法有常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原用于可溶性抗原(蛋白质蛋白质)、细胞和病毒、细胞和病毒等等McAb的检测。的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。的检测。3.FACS(流式细胞术流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的用于检查细胞表面抗原的McAb检测。检测。第66页，共87页。（四）杂交瘤的冻存和克隆化（四）杂交瘤的冻存和克隆化1.克隆化方案克隆化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。有限稀释和软琼脂平板法。(1)有限稀释法有限稀释法 (2)软琼脂法软琼脂法第67页，共
38、87页。2.杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存细胞冻存液细胞冻存液:50小牛血清小牛血清40不完全培养液不完全培养液10DMSO(二甲亚砜二甲亚砜)第68页，共87页。（五）单克隆抗体的大量生产（五）单克隆抗体的大量生产n大量生产单克隆抗体的方法主要有两大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：种：1.体外使用旋转培养管大量体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为液含量为1060gml，如果大量，如果大量生产，费用较高。生产，费用较高。n 2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水体内接种杂交瘤
39、细胞，制备腹水或血清。或血清。第69页，共87页。（六）单克隆抗体的鉴定六）单克隆抗体的鉴定1.抗体特异性的鉴定：抗体特异性的鉴定：2.McAb的的Ig类与亚类的鉴定：类与亚类的鉴定：3.McAb中和活性的鉴定：中和活性的鉴定：4.McAb亲和力的鉴定：亲和力的鉴定：第70页，共87页。抗体的纯化：抗体的纯化：n硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀n离子交换层析离子交换层析nSPA-sepharose 亲和层析柱分离亲和层析柱分离第71页，共87页。影响杂交瘤技术的因素影响杂交瘤技术的因素n1、试剂与器材、试剂与器材 用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂n2、培养技术、
40、培养技术 防止污染，细胞培养的娴熟技能防止污染，细胞培养的娴熟技能n3、早期克隆化、早期克隆化 避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免 克隆细胞的丢失。克隆细胞的丢失。第72页，共87页。第四节第四节 基因工程抗体技术基因工程抗体技术 Genetic Engineering Technique 是指应用是指应用NDA重组及蛋白工程技术对编重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。基因工程抗体基因工程抗体(重组抗体重组抗体)
41、第73页，共87页。基因工程抗体技术基因工程抗体技术n用用DNA重组和蛋白工程技术对已有的重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造。单抗进行改造。包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。n用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。第74页，共87页。一、人源化抗体一、人源化抗体n1.将小鼠的将小鼠的CDR序列移植到人抗序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称体可变区框架中，产生的抗体称为为CDR移植抗体。移植抗体。n2.将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基基因，在小鼠体内产生人因，在小鼠体内产生人Ab，再经，再经杂交瘤技术，产生
42、大量完全人源杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。化抗体。第75页，共87页。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点：1.减少了鼠源性抗体的免疫原性 2.保留了亲本抗体特异性结合抗 原的能力。1.1.嵌合抗体嵌合抗体(chimeric antibody)(chimeric antibody)第76页，共87页。嵌合抗体(chimeric antibody)第77页，共87页。指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化
43、抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR”移植抗体，RAb的产生和发展，使得多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗，包括通过人体免疫难以诱生的特异性的抗人抗原抗体，因而有诱人的前景。2.改形抗体（RAb）第78页，共87页。第79页，共87页。二、小分子抗体二、小分子抗体n指分子量较小但具有抗原结合功指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。能的分子片段。抗原结合片段（抗原结合片段（FabFab）可变区片段（可变区片段（FvFv）单链抗体（单链抗体（single chain Fvsingle chain Fv，ScFvScFv）优点：优点：分子小，通透性强
44、分子小，通透性强 原核细胞表达，成本低原核细胞表达，成本低 不含不含Fc段，不与带段，不与带Fc段受体反应段受体反应 半衰期短，利于及时清除半衰期短，利于及时清除第80页，共87页。小分子抗体第81页，共87页。三、双特异性抗体三、双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）n双特异性抗体，双功能抗体双特异性抗体，双功能抗体 其两个抗原结合部位具有不同其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。异性的抗原发生结合。第82页，共87页。双特异性抗体（双特异性抗体（BsAb）种类：）种类：（一）化学绞链（一）化学绞链
45、BsAb（二）细胞工程（二）细胞工程BsAb（三）基因工程（三）基因工程BsAb第83页，共87页。四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白（一）含（一）含Fv的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白（二）含（二）含Fc的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物蛋白融合所得到的产物。第84页，共87页。第五节第五节 抗体库技术抗体库技术n噬菌体抗体噬菌体抗体n噬菌体抗体库噬菌体抗体库n噬菌体抗体技术噬菌体抗体技术第85页，共87页。第86页，共87页。从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库第87页，共87页。
