1、TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第八章第八章 糖基转移酶和糖苷酶糖基转移酶和糖苷酶第1页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第一节第一节 糖基转移酶糖基转移酶(Glycosyltransferases)l糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶。物中糖链合成的一类酶。l负责将活性供体负责将活性供体(通常是通常是NDP-NDP-糖糖)的单糖转移到的单糖转移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完成糖基化反糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完成糖基化反应。应。l目前发现的糖基转移酶有目前发现的糖基转移酶有1
2、00100多种，其主要分多种，其主要分布在内质网和高尔基体。布在内质网和高尔基体。第2页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第3页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第4页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY一、糖基转移酶的命名与分类一、糖基转移酶的命名与分类l糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖类型进行分类的。糖类型进行分类的。l如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。l另外一种方法是根据序列的同源性、底物另外一种方法是根据序列的同源性、底物/产产物立体
3、化学异构性以及供体糖进行分类。物立体化学异构性以及供体糖进行分类。l这种分类法糖基转移酶被分为这种分类法糖基转移酶被分为6666个家族及一个未分个家族及一个未分类族。类族。l所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个超家族，分别为超家族，分别为GT-A和和GT-B超家族。超家族。第5页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的命名糖基转移酶的命名lGlcNAc T-I的全称为：的全称为：lUDP-N-乙酰葡糖胺乙酰葡糖胺:-3-甘露糖基甘露糖基-1,2N-乙乙酰葡糖胺转移酶。酰葡糖胺转移酶。lGlcNAc T-II的全称为：的全称
4、为：lUDP-N-乙酰乙酰葡糖胺葡糖胺:-6-甘露甘露糖基糖基-1,2N-乙乙酰葡糖胺转移酶。酰葡糖胺转移酶。第6页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY -1,4-Galactosyltransferase Family第7页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Fucosyltransferase Family 第8页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY All members of the sialyltransferase genes cloned第9页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYThe Ev
5、olutionary History of Glycosyltransferase Genes后生动物后生动物后口动物后口动物脊椎动物脊椎动物哺乳动物哺乳动物原始昆虫原始昆虫无脊椎动物无脊椎动物非哺乳动物非哺乳动物第10页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY二、糖基转移酶特性二、糖基转移酶特性l一个基一个基因因 一种转移一种转移酶酶 一种连接键一种连接键l糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。完成的。l每
6、个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。l糖链可以认为是基因的次级产物糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转一个基因编码一个糖基转移酶移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。也就对应了一个基因组。第11页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶特性糖基转移酶特性l糖基转移酶绝大部分
7、是糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即较型膜结合蛋白，即较短的短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内质网或端在胞浆，有一穿膜部分通过内质网或高尔基体膜，长的高尔基体膜，长的C-端在内质网或高尔基体的管端在内质网或高尔基体的管腔内。腔内。l有少数糖基转移酶是有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较短型膜结合蛋白，其较短的的N-端在内质网腔，而很长的端在内质网腔，而很长的C-端则定位于端则定位于胞浆。胞浆。第12页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYBiological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltr
8、ansferase V(GnT-V)第13页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYRegulation of High Branching in N-linked Oligosaccharides第14页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第15页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY大鼠不同组织中三种大鼠不同组织中三种-乙酰葡糖胺基转移酶乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAc T)组织组织活力活力(pmolmg蛋白蛋白h)GlcNAc T-IIGlcNAc T-IVGlcNAc T-V肾肾1840 3301.9 1.630 6脑脑660
9、 488.7 0.738 1胃胃500 1508.2 0.725 1小肠小肠280 9917 1.568 11肺肺104 4.62.6 0.738 4脾脾100 2.520 821 2睾丸睾丸52 2.98.2 0.837 4心心11 1.19.4 1.410 1肝肝81 0.92.8 0.78.2 0.8第16页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 三、糖基转移酶的结构域三、糖基转移酶的结构域l属于属于II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个结构域。结构域。l氨基端的胞浆域，氨基端的胞浆域，一般少于一般少于2525个个(最少最少4 4个个)
10、氨基氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；l穿膜域，穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；l颈区域，颈区域，位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链。糖链。第17页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的结构域糖基转移酶的结构域l催化域，催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状，约为管腔中的最大结构域，呈球状，约含含310-430310-430个个(最长可达最长可达720720个左右个左右)氨基酸残基，氨基酸残基，为糖基
11、转移酶最重要的催化区域。为糖基转移酶最重要的催化区域。第18页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域第19页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 四、糖基转移酶的催化特性与功能四、糖基转移酶的催化特性与功能(1)(1)底物专一性底物专一性l糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。的底物专一性和催化特性来决定的。l对对底物专一底物专一性，性，一个酶的产物常作为下一个酶一个酶的产物常作为下一个酶的底物，这样就保证了糖链
12、中糖基的特定顺序。的底物，这样就保证了糖链中糖基的特定顺序。l因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用的供体和受体也不同。的供体和受体也不同。第20页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l合成糖原时，葡萄糖的供体是合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合成合成淀粉时，则是淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素时是合成纤维素时是GDP-Glc。l对受体的专一性对受体的专一性，在糖蛋白的在糖蛋白的N-糖苷糖苷键连接的键连接的糖链的外周有糖链的外周有6 6种不同的方式连接的种不同的方式连接
13、的N-乙乙酰酰葡葡糖胺糖胺(GIcNAc),GIcNAc),它们连接在不同甘露糖基它们连接在不同甘露糖基(Man)Man)的不同的不同糖糖基上基上，分别有分别有6 6个不同的个不同的糖糖基转移酶负责基转移酶负责它它们的转移们的转移，每个酶又对应不同的受体每个酶又对应不同的受体。第21页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同第22页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY人人B B血型的血型的 1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性半乳糖基转移酶对受体底物的专一性第23页，共11
14、1页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l唾液酸化唾液酸化Lewis X四糖抗原合成时，一四糖抗原合成时，一般先生成唾液酸化的般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，再乙酰乳糖胺，再由由-1,3Fuc T在在G1cNAc上加入上加入Fuc，而不而不能先合成岩藻糖化的能先合成岩藻糖化的N-乙酰乳糖胺后再加乙酰乳糖胺后再加上上NeuAc。因。因-2,3 NeuAc T不能以不能以-1,3岩藻糖化糖链为底物。岩藻糖化糖链为底物。第24页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l糖基转移酶也可作用
15、于人工底物，如参与糖蛋白糖糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末端标记端标记(荧光和放射性核素荧光和放射性核素)的底物。的底物。l不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的底物。底物。第25页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性(2)(2)二价金属离子的需
16、求二价金属离子的需求l大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为辅助因子，缺乏二价金属离子时辅助因子，缺乏二价金属离子时(如在如在EDTA存在下存在下)酶活力很低或丧失。酶活力很低或丧失。l二价金属离子中二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其次是的激活作用最强，其次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。l糖基转移酶糖基转移酶 T-V不需要二价金属离子。不需要二价金属离子。第26页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 五、糖基转移酶同源性和抗原性五、糖基转移酶同源性和抗原性l糖基转移酶在结构上的最大特点是不同糖糖基转移酶在结构上的最大特点是不
17、同糖基转移酶一级结构之间的同源性很少，即基转移酶一级结构之间的同源性很少，即使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同源性。源性。l血型血型A抗原的抗原的GalNAc T和血型和血型B抗原的抗原的Gal T同源性达同源性达9999，在，在353353个氨基酸残基个氨基酸残基中只有中只有4 4个不同。个不同。第27页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶同源性和抗原性l不同种属中同一糖基转移酶的同源性极大，不同种属中同一糖基转移酶的同源性极大，其催化结构域的同源性一般均在其催化结构域的同源性一般均在8080以上
18、。以上。l如人、小鼠和兔中如人、小鼠和兔中-1,2GlcNAc T-I四个四个结构域的同源性分别为结构域的同源性分别为100%100%、90%90%、80%80%和和95%95%。第28页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY六、糖基转移酶和疾病六、糖基转移酶和疾病l-1,3 T的活性在人体内的重现会引发自身免的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应。相反，如果人体内疫反应。相反，如果人体内-1,4半乳糖基转半乳糖基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白G(IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低。分子中的糖链半乳糖含量降低。l它能诱导抗体产生，
19、从而也会出现自身免疫，其症它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，其症状是类风湿。状是类风湿。第29页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如糖如糖链分支末端出现重复链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结构、唾乙酰半乳糖胺结构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。常用作肿瘤标记物。l糖基转移酶就是通过影响糖链的改变糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而间接而间接关系到癌瘤发生和发展。关系到癌瘤发生和发展。第30页，共11
20、1页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。l在细胞分化阶段在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟细胞如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高中活性很高，就会产生癌变就会产生癌变，同时出现早期的同时出现早期的分化抗原。分化抗原。l多聚多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志。要标志。l这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步侵入。癌细胞的进一步侵入。第31页，共111页。TOOLS FOR
21、 GLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l与肝癌发生有关的糖基转移酶与肝癌发生有关的糖基转移酶l糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如GnT-、GnT-和和-1,6岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶。lGnT-和和GnT-能将一个能将一个N-乙酰葡糖胺转移至乙酰葡糖胺转移至N-糖链五糖核心糖链五糖核心1,3和和1,6臂甘露糖上臂甘露糖上,分别形成分别形成-1,4和和1,6键，使键，使N-糖链天线数增多，糖链天线数增多，-1,6 FucT则将岩藻糖转移至糖链最内侧则将岩藻糖转移至糖链最内侧(与天冬酰胺相与天冬酰胺相邻邻)的的N-乙酰葡糖胺上形成核心
22、岩藻糖。乙酰葡糖胺上形成核心岩藻糖。第32页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白上上，使肿瘤细胞表面性质变化使肿瘤细胞表面性质变化，导致细胞粘导致细胞粘附、侵袭和迁移能力改变附、侵袭和迁移能力改变，是造成肿瘤细胞是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。第33页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY七、糖基转移酶的应用七、糖基转移酶的应用l糖基转移酶在肝癌研究中的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用l
23、恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、预防预防方面方面有重要意义有重要意义。l将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表达的过表达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化,产生不产生不同糖型同糖型，通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结合合，比较转染组和非转染组糖蛋白改变比较转染组和非转染组糖蛋白改变，从从而确定蛋白质和糖基化的功能关系而确定蛋白质和糖基化的功能关系,研究研究为糖基为糖基化改变在
24、肝癌发生中的作用研究奠定了基础。化改变在肝癌发生中的作用研究奠定了基础。第34页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用l采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化改变改变，并从结构上描述糖链并从结构上描述糖链，旨在将其作为乳旨在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶点点。第35页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYl糖基转移酶在糖基转移酶在糖糖类合成中的应用类合成中的应用l糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病糖类药物在治疗炎症
25、、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。毒等方面都有其独特的功效。l现在普遍使用的糖类合成方法有两种现在普遍使用的糖类合成方法有两种：化学合成和酶促合成化学合成和酶促合成l化学合成近年来取得一些进展化学合成近年来取得一些进展，提出了一种全提出了一种全自动寡自动寡糖糖合成法合成法，但在天然复合产物中以一种糖但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。代替另一种糖仍然困难。l酶促合成酶促合成的的产量高、产物产量高、产物具有具有特异立体化学异构特异立体化学异构性。性。糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用第36页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY糖基转移酶的应用糖基转移酶
26、的应用l糖基转移酶可作为研究糖复合物工具糖基转移酶可作为研究糖复合物工具l如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰等。胞表面糖基化修饰等。第37页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY八、八、O-GlcNAc 糖基转移酶在原核糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯和真核细胞中的表达和提纯l南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系合作。所神经生化系合作。lO-GlcNAc 糖基化修饰起到调节蛋白质的活性糖基化修饰起到调节蛋白质的活性，在生命在生命过程的许多
27、方面起作用过程的许多方面起作用(如核运输如核运输，基因转录及翻译过基因转录及翻译过程程)。lOGT 基因敲除实验表明蛋白质基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc 糖基化修饰是糖基化修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc 糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc 糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。争、相互补充的关系。第38页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYl细胞质和细胞核内的蛋白质细胞质和细胞核内的蛋白质
28、O-GlcNAc糖基化和糖基化和去糖基化分别由去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶糖基转移酶(OGT)和和O-GlcNAc 糖苷酶催化。糖苷酶催化。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学意义糖基化修饰及其生物学意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之一。一。l其研究目的：其研究目的：l用原核和真核细胞表达用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的方法并用不同的方法从这两个系统提纯重组从这两个系统提纯重组OGT，获得制备有活获得制备有活性的性的OGT，用于进行用于进行O-GlcNAc糖基酶功能方糖基酶功能方面的研究。面的研究。第39
29、页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY研究结果研究结果l用大肠杆菌和用大肠杆菌和Hi5 昆虫细胞表达并纯化具有活性昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组的重组OGT。l携带人携带人OGTcDNA的的PET 32a 质粒在大肠杆菌中质粒在大肠杆菌中表达出带有表达出带有1个个S-Tag 的重组人的重组人OGT 融合蛋白，融合蛋白，然后用与然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到裂解液中亲和层析纯化得到OGT 融合蛋白。融合蛋白。l其纯化的其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具有生物在电泳中显现单一条带并具有生物活性活性，但
30、其活性在洗脱后丧失。但其活性在洗脱后丧失。第40页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYIPTG 诱导重组诱导重组OGT 在在BL 21 大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达第41页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY大肠杆菌中表达的重组大肠杆菌中表达的重组OGT 经经S-蛋白质凝胶纯化蛋白质凝胶纯化第42页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY研究结果研究结果l在在Hi5 昆虫细胞中表达的鼠肝昆虫细胞中表达的鼠肝OGT，经镍离子螯合柱纯经镍离子螯合柱纯化后化后,其比活性达到其比活性达到0.88 nmolmin-1mg-1OGT。Hi5
31、 细胞中表达的重组细胞中表达的重组OGT 的纯化的纯化第43页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析l利用与植物次生代谢产物糖基化相关的利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域糖基转移酶的特征性保守区域，设计了同源引物设计了同源引物。l以甜菊基因组以甜菊基因组DNA 为模板，为模板，PCR 扩增获得甜扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段菊糖基转移酶基因片段。l根据获得的基因片段设计引物根据获得的基因片段设计引物GSTr 和和GSTf，分别与分别与cDNA文库的文库的T3 和和T7 通用
32、引物扩增获得通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因。全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因。第44页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第45页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYThe level of expression of plant glycosyltransferases第46页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYTransgenic pigs with GnT-III第47页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYRecombinant plant glycosyltransferase
33、s reported recently(20012004)第48页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l葡糖基转移酶葡糖基转移酶是致是致龋龋菌的重要致病因素之一菌的重要致病因素之一，具有利用具有利用蔗糖蔗糖合成细胞外葡聚合成细胞外葡聚糖糖的催化活性和的催化活性和结合结合葡聚糖的活性葡聚糖的活性，在细菌附着和菌斑形成的过在细菌附着和菌斑形成的过程中起着重要作用程中起着重要作用。l抑制抑制GTF活性活性，减少葡聚糖的产生是控制菌震斑减少葡聚糖的产生是控制菌震斑预防预防龋龋病的重要手段之一病的重要
34、手段之一。l目的：目的：动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗HDS 免疫免疫原性和防龋效果。原性和防龋效果。第49页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l方法：方法：构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原多肽抗原HDS，葡糖基转移酶葡糖基转移酶(GTF)免免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠血清和唾液中抗疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠血清和唾液中抗HDS、GTF抗体；体视显微镜下观察各组大鼠磨抗体；体视显微镜下观察
35、各组大鼠磨牙龋坏情况，并用牙龋坏情况，并用Keyes计分法计分。计分法计分。第50页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l结果：结果：lHDS-KLH免疫组大鼠唾液、血清中抗免疫组大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和和IgA 水平均高于对照组水平均高于对照组(P 0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫组大鼠龋免疫组大鼠龋Keyes 计分均低计分均低于对照组于对照组(P 0101)，光滑面防龋效果最为显光滑面防龋效果最为显著。著。l结论：结论：l人工抗原人工抗原 HDS-KLH 能刺激机
36、体产生针对能刺激机体产生针对GTF 的保护性免疫的保护性免疫，并减少实验大鼠龋齿发生。并减少实验大鼠龋齿发生。第51页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY葡糖基转移酶抗体的制备与研究葡糖基转移酶抗体的制备与研究l以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。l应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫球应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫球蛋白的活性。蛋白的活性。l经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋黄抗体，经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般其抗远援链球菌的效价约为一般IgY的的1616倍。倍。l体外模拟实验表明经远援链球
37、菌免疫的蛋黄抗体体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备防龋齿的确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备防龋齿的功效。功效。第52页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第二节第二节 糖苷酶糖苷酶l糖糖苷苷酶酶(G1ycosidase)是一大类催化糖是一大类催化糖苷苷键水键水解解的酶的酶类。类。l其主要分布在动物、植物、微生物体内，其主要分布在动物、植物、微生物体内，担担负着水解各种负着水解各种糖糖苷苷、寡、寡糖糖、多、多糖糖、复杂多糖以、复杂多糖以供机体供机体利利用的生物学功能用的生物学功能。l大多数糖苷酶水解典型大多数糖苷酶水解典型O-糖苷
38、键糖苷键，也有部分水解，也有部分水解N-糖苷键糖苷键，有一些糖苷酶水解，有一些糖苷酶水解S-糖苷键糖苷键。第53页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY一、一、糖苷酶的分类糖苷酶的分类l按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分为两大类：为两大类：l外切糖苷酶类（外切糖苷酶类（Exoglycosidases)：它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，逐步它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为单糖或双糖；将糖苷键切断，所得到的水解产物为单糖或双糖；l内切糖苷酶类（内切糖苷酶类（Endoglycosidases
39、)：它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物的寡糖。小于原来底物的寡糖。第54页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYExo-1-4-Beta-D-Glycanase第55页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第56页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY二、二、糖苷酶的分布糖苷酶的分布l糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。植物和微生物体内都能找到糖苷键。l在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种组织
40、在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种组织器官中都有存在。器官中都有存在。l许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。l植物种子里有丰富的糖苷酶。植物种子里有丰富的糖苷酶。l一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当的研究报一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当的研究报道。道。第57页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY三、三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名l糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。l底物专一性包含：底物专一性包含：l糖基一侧的专一性；糖基一侧的专一性；l糖苷键的糖苷键的-异头专一性；异头专一性；l糖苷配基一
41、侧的专一性。糖苷配基一侧的专一性。l糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷键的键的-异头专一性来命名的。异头专一性来命名的。l-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、-半乳糖苷半乳糖苷酶、酶、-甘露甘露糖苷酶等。糖苷酶等。第58页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY(1)(1)糖基一侧的专一性糖基一侧的专一性(2)(2)糖苷键的糖苷键的-异头专一性异头专一性(3)(3)糖基配基一侧的专一性糖基配基一侧的专一性第59页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY四、四、糖苷酶的生物学功能糖苷酶的生物学功能(
42、1)(1)分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的胞外分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的胞外消化吸收过程。消化吸收过程。(2)(2)细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体中有细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内的糖复合一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内的糖复合物。物。(3)(3)参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过程参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过程中，参加中，参加N-型糖链的型糖链的“剪枝剪枝”，“修剪修剪”成较成较短分支短分支(Man3GlcNAc-Asn)结构，然后再由糖基结构，然后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同结构的糖链。转移酶加上新的糖基，
43、形成不同结构的糖链。第60页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第61页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第62页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第63页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYBiological Roles of N-glycanase in Cells第64页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第65页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY第66页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY五、一些常见的五、一些常见的糖苷酶糖苷
44、酶l-D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l-D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l-D-木糖苷酶木糖苷酶l,-鼠李糖苷酶鼠李糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶l-D-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麦芽糖酶。淀粉麦芽糖酶。l唾液酸酶唾液酸酶(神经氨酸酶类神经氨酸酶类)。第67页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY一些常见的一些常见的糖苷酶糖苷酶l-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶
45、l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶l -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶第68页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY水解不同类型糖苷键的糖苷酶水解不同类型糖苷键的糖苷酶第69页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY六、六、糖苷酶的制备方法糖苷酶的制备方法l黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选l将筛选用将筛选用菌株菌株Absida sp.A9r、A84r、A9r、A8r、A38r、Arr进行培养制备酶液进行培养制备酶液 以黄芪以黄芪总皂苷为底物进行诱导总皂苷为底物进行诱导 薄层层析法薄层层析法检测水解检测水解结
46、果结果。l结果：结果：A bsida sp.A3r 菌所产酶液能较好的水菌所产酶液能较好的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷，进而生成进而生成糖基较少的皂苷。糖基较少的皂苷。第70页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYl绿色木霉产生的外切绿色木霉产生的外切-葡聚糖苷酶葡聚糖苷酶l从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本 加适量的无菌水温和搅拌加适量的无菌水温和搅拌取取1 ml 悬浊液悬浊液,分别分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上涂于含有滤纸的固体筛选培养基上待长出若干待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进行分离菌落后，对生
47、长良好的菌种进行分离以以羧甲羧甲基纤维素钠为底物分别测定其所产酶活性。基纤维素钠为底物分别测定其所产酶活性。l菌培养液菌培养液过滤过滤上清液上清液硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀Sephadex 柱层析柱层析DEAE2纤维素纤维素52 阴离子交阴离子交换柱层析换柱层析收集洗脱纯酶液。收集洗脱纯酶液。第71页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYl一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离l采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微生采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株的菌株YW2
48、112，该酶能特异性水解神经节苷该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键，脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。第72页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGYl人参糖苷酶提取人参糖苷酶提取l目的目的：用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。l方法：方法：从鲜人参根中提取人参皂苷酶从鲜人参根中提取人参皂苷酶，乙醇沉淀乙醇沉淀，离子交换层析纯化离子交换层析纯化，凝胶电泳分析凝胶电泳分析，薄层色谱薄层色谱法测酶活力。法测酶活力。l结果：结果：经离子交换层析得
49、到人参皂苷经离子交换层析得到人参皂苷-葡糖苷酶。葡糖苷酶。第73页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY七、七、糖苷酶的分离、纯化和测定糖苷酶的分离、纯化和测定l糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上和一般糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。l常用的方法：常用的方法：盐析盐析(硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀)、柱层析、柱层析(离子交换、凝胶过离子交换、凝胶过滤、亲和层析、吸附滤、亲和层析、吸附)，电泳等。电泳等。第74页，共111页。TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY一些糖苷酶的分离纯化方法一些糖苷酶的分离
50、纯化方法来来 源源酶的名称酶的名称方方 法法刀豆粉刀豆粉-甘露糖苷酶甘露糖苷酶乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶柱层析柱层析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶无花果无花果-半乳糖苷酶半乳糖苷酶丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、等电聚胶柱层析、等电聚胶产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、制备电泳换柱层析、制备电泳猪肾猪肾-甘露糖苷酶甘露糖苷酶硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理硫酸铵沉淀、丙酮沉淀
