1、课题课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课标领航课标领航1举例说明什么是选择培养基，并研究培举例说明什么是选择培养基，并研究培养基对微生物的选择作用。养基对微生物的选择作用。2设置重复组和对照组，对土壤中分解尿设置重复组和对照组，对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数。素的细菌进行分离和计数。【重点】【重点】选择培养基的作用。选择培养基的作用。【难点】【难点】菌落数目的统计。菌落数目的统计。情境导引情境导引德国著名化学家维勒是尿素的发现者。他在一次实验德国著名化学家维勒是尿素的发现者。他在一次实验中，意外地发现在金属氰化物和氨水相互作用时，经中，意外地发现在金属
2、氰化物和氨水相互作用时，经温水加热，容器的底部出现了一些白色的沉淀物。一温水加热，容器的底部出现了一些白色的沉淀物。一种强烈的好奇心驱使他要探个究竟，他紧紧抓住这种种强烈的好奇心驱使他要探个究竟，他紧紧抓住这种新的实验现象，反复实验研究，精心论证，经过近四新的实验现象，反复实验研究，精心论证，经过近四年的艰苦努力，终于在年的艰苦努力，终于在1828年查明，金属氰化物和氨年查明，金属氰化物和氨水相互作用，首先生成的物质是氰酸铵，氰酸铵经加水相互作用，首先生成的物质是氰酸铵，氰酸铵经加热就会转化为尿素。热就会转化为尿素。核心要点突破核心要点突破知能过关演练知能过关演练课课题题2土土壤壤中中分分解解
3、尿尿素素的的细细菌菌的的分分离离与与计计数数基础自主梳理基础自主梳理基础自主梳理基础自主梳理一、研究思路一、研究思路1自然界中目的菌株的筛选自然界中目的菌株的筛选(1)依据：根据它对依据：根据它对_的要求，到相应的要求，到相应的环境中去寻找。的环境中去寻找。(2)实例：实例：PCR技术过程中用到的耐高温的技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌细菌中分离到的。中分离到的。生存环境生存环境2实验室中目的菌株的筛选实验室中目的菌株的筛选(1)理论依据理论依据人为提供有利于人为提供有利于_生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、
4、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生，同时抑制或阻止其他微生物生长。长。(2)选择培养基选择培养基指在微生物学中，允许指在微生物学中，允许_种类的微生物生长，种类的微生物生长，同时同时_或阻止其他种类微生物生长的培养基。或阻止其他种类微生物生长的培养基。目的菌株目的菌株特定特定抑制抑制3统计菌落数目统计菌落数目(1)常用方法：常用方法：_法。法。统计依据统计依据a当样品的当样品的_足够高时，培养基表面生长足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个的一个菌落来源于样品稀释液中的一个_。b通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含
5、有的活菌数。的活菌数。注意事项：为保证结果准确，一般选择菌落数在注意事项：为保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。(2)其他方法：利用其他方法：利用_直接计数。直接计数。4设置对照设置对照目的是排除实验组中目的是排除实验组中_对实验结果的对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。影响，提高实验结果的可信度。活菌计数活菌计数稀释度稀释度活菌活菌显微镜显微镜非测试因素非测试因素二、实验设计二、实验设计1土壤取样土壤取样(1)土壤要求：富含土壤要求：富含_、pH接近接近_且潮湿。且潮湿。(2)取样部位：距地表约取样部位：距地表约38 cm的土壤层。的土壤层。2样品处理
6、样品处理样品的样品的_直接影响平板上生长的直接影响平板上生长的_，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在在30300之间，便于计数。之间，便于计数。有机质有机质中性中性稀释程度稀释程度菌落菌落3微生物的培养与观察微生物的培养与观察将培养基平板放于将培养基平板放于3037 温室中培养温室中培养12天，天，每隔每隔24 h统计一次统计一次_数目，最后选取数目稳定数目，最后选取数目稳定时的记录作为结果。时的记录作为结果。4细菌的计数细菌的计数当菌落数目稳定时，取同一当菌落数目稳定时，取同一_下的至少下的至少3个个平板进行计数，求出平均值，并根据所对
7、应的公平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的公式计算出样品中细菌的数目。式计算出样品中细菌的数目。菌落菌落稀释度稀释度三、结果分析与评价三、结果分析与评价1培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落筛选出菌落_的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显明显_选择培养基的数目，说明选择培养基已选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。筛选出一些菌落。2样品的稀释操作是否成功样品的稀释操作是否成功如果得到了如果得到了
8、2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。计数。对照对照大于大于3重复组的结果是否一致重复组的结果是否一致如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该_。四、操作提示四、操作提示1无菌操作无菌操作(1)取土样的用具在使用前都需要取土样的用具在使用前都需要_。(2)应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将土样倒应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将土样倒入烧瓶中，塞好棉塞。入烧瓶中，塞好棉塞。(3)在在_土壤溶液的过程中，每一步都要在土壤溶液的过程中，每
9、一步都要在_旁操作。旁操作。接近接近灭菌灭菌稀释稀释火焰火焰2做好标记做好标记本实验使用的本实验使用的_和试管比较多，为避免混和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。淆，最好在使用前就做好标记。3规划时间规划时间对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。五、课题延伸五、课题延伸细菌合成的细菌合成的_将尿素分解成氨，使培养基将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变加入酚红指
10、示剂培养细菌，若指示剂变_，可确定该种细菌能够分解尿素。可确定该种细菌能够分解尿素。平板平板脲酶脲酶红红核心要点突破核心要点突破选择培养基选择培养基选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物.1加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。2加入高浓度的食盐溶液可得到金黄色葡萄球菌加入高浓度的食盐溶液可得到金黄色葡萄球菌.3如培养基中缺乏氮源时，可以分离
11、固氮微生物，如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。4当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。例如，石油是惟一碳源时，可也具有分离效果。例如，石油是惟一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离出能消除石油污用石油的微生物生存，达到分离出能消除石油污染的微生物的目的。染的微生物的目的。5改变微生物的培养条件，也可以达到分离微改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基
12、放在高温环境中培养只生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。能得到耐高温的微生物。(2011年青岛市高二检测年青岛市高二检测)氯苯化合物是重要氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案研究小组依照下列实验方案(图图1)筛选出能高效降解筛选出能高效降解氯苯的微生物氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表菌，培养基配方如表1。图图1表表1培养基的组成培养基的组成液体培液体培养基养基蛋白蛋白胨胨牛肉牛肉膏膏氯苯氯苯氯氯化化钠钠硝硝酸酸铵铵无机无机盐盐(无无碳碳)蒸蒸馏馏水水号号10 g5 g5
13、mg5 g1 L号号50 mg5 g3 g 适量适量 1 L号号2080 mg5 g3 g 适量适量 1 L(1)配制配制号固体培养基时，除添加号固体培养基时，除添加号液体培养号液体培养基成分外，还应添加基成分外，还应添加1%的的_。(2)培养基配制时，灭菌与调培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是的先后顺序是_。(3)从用途上来说，从用途上来说，号培养基和号培养基和号培养基分别号培养基分别属于属于_培养基和培养基和_培养基。在培养基。在号培养基中，为号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是菌提供氮源的成分是_。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一的菌体会变
14、成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。(5)将将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液号培养液中培养，得到生长曲线中培养，得到生长曲线(如图如图2)。从图。从图2可知可知SP1菌在菌在_培养条件下最早停止生长，其原培养条件下最早停止生长，其原因是因是_。图图2【尝试解答】【尝试解答】(1)琼脂琼脂(2)先调先调pH，后灭菌，后灭菌(3)通用选择硝酸铵通用选择硝酸铵(4)芽孢芽孢(5)20 mg/L 氯苯碳源最早耗尽氯苯碳源最早耗尽【解析】【解析】(1)固体培养基必须含有适量的琼脂。固体培养基必须含有适量的琼脂。(2)配制培养基时应先调配
15、制培养基时应先调pH后灭菌。后灭菌。(3)号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，培养基，号培养基是为选择出号培养基是为选择出SP1菌株，属于菌株，属于选择培养基，选择培养基，号培养基成分中含号培养基成分中含N物质为硝酸物质为硝酸铵，则应由它为铵，则应由它为SP1菌株提供氮源。菌株提供氮源。(4)在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境。度过不良环境。(5)SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，因缺少碳源而不能继续生存
16、，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。菌株越早停止生长。跟踪训练跟踪训练某种细菌必须从环境中摄取亮氨酸才某种细菌必须从环境中摄取亮氨酸才能正常生活，此菌株对链霉素敏感能正常生活，此菌株对链霉素敏感(即缺乏抗性即缺乏抗性)。实验者用诱变剂处理此种菌株，欲从经处理的菌实验者用诱变剂处理此种菌株，欲从经处理的菌株中筛选出不依赖亮氨酸且对链霉素不敏感株中筛选出不依赖亮氨酸且对链霉素不敏感(即即有抗性有抗性)的变异类型，则应选用的培养基是下表的变异类型，则应选用的培养基是下表中的中的()选项选项亮氨酸亮氨酸链霉素链霉素ABCD注：注：表格中表格中“”表示加入，表示加入，“”表示未加表示未加入；入；4
17、种培养基除添加亮氨酸和链霉素有差异种培养基除添加亮氨酸和链霉素有差异外，其他成分及条件均相同且适合细菌生长。外，其他成分及条件均相同且适合细菌生长。解析：解析：选选C。解答本题首先必须弄清选择的目标。解答本题首先必须弄清选择的目标是要选出不依赖亮氨酸且对链霉素有抗性的菌株，是要选出不依赖亮氨酸且对链霉素有抗性的菌株，因此培养基要针对目的菌株的上述两个特点配制：因此培养基要针对目的菌株的上述两个特点配制：无亮氨酸无亮氨酸(不依赖，能存活不依赖，能存活)，有链霉素，有链霉素(有抗性，有抗性，对链霉素不敏感，其存在不影响其生存对链霉素不敏感，其存在不影响其生存)。显微镜直接计数法与稀释涂布平显微镜直
18、接计数法与稀释涂布平板法的比较板法的比较显微镜直接计数法是利用血球计数板在显微镜下显微镜直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法是将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板的载是将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的计数。由于计数室的容积是一定的(0.1 mm3)，所，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。算成单位体积内的微生物总
19、数目。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，故又称为由于此法计得的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。此法的优点是直观、快速，但需要总菌计数法。此法的优点是直观、快速，但需要与血球计数板配套使用，且计数随机性大，所以与血球计数板配套使用，且计数随机性大，所以对菌体数量不能做出较为宏观、全面的反映。对菌体数量不能做出较为宏观、全面的反映。平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大。由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，性范围大。由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好地反映菌落的疏密程度，重复性、平行性能较好地反映菌落的疏密程度，重复性、平行性好，是经典
20、的计数方法。但需要平板上长出菌落好，是经典的计数方法。但需要平板上长出菌落一段时间后才能计数，因此速度慢是最大的缺点。一段时间后才能计数，因此速度慢是最大的缺点。某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为106的培养基上测得的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样，那么每毫升样品中菌落数是品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)()A2.34108B2.34109C234 D23.4【尝试解答】【尝试解答】_B_【解析】【解析】稀释倍数为稀释倍数为106,0.1 mL稀释液的菌落数稀释液的菌落数的平均值为的平均值为
21、234，则每毫升样品中菌落数就为，则每毫升样品中菌落数就为234/0.11062.34109。【易误警示】【易误警示】在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组；在分析实验结果时，一定要个平板作为重复组；在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果结果考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果结果差别过大，则意味着操作有误，需重新实验。差别过大，则意味着操作有误，需重新实验。跟踪训练跟踪训练用稀释涂布平板法测定同一土壤样品用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，的培养基中，得到以下几
22、种统计结果，正确的是得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了涂布了1个平板，统计的菌落数是个平板，统计的菌落数是230B涂布了涂布了2个平板，统计的菌落数是个平板，统计的菌落数是215和和260，取平均值取平均值238C涂布了涂布了3个平板，统计的菌落数分别是个平板，统计的菌落数分别是21、212和和256，取平均值，取平均值163D涂布了涂布了3个平板，统计的菌落数分别是个平板，统计的菌落数分别是210、240和和250，取平均值，取平均值233解析：解析：选选D。在设计实验时，一定要涂布至少。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以与准确性，所以A、B两项不正确。两项不正确。C项虽涂布项虽涂布了了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的计数结果与个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数个平板的计数值求平均值。值求平均值。知能过关演练知能过关演练本部分内容讲解结束本部分内容讲解结束点此进入课件目录点此进入课件目录按按ESC键退出全屏播放键退出全屏播放谢谢使用谢谢使用
