1、细胞的原代培养（研究生实验教学）实验目的 熟悉细胞培养的基本条件和准备工作 熟悉并掌握原代培养中取材、消化、收集细胞和接种等基本实验技术 了解细胞原代培养的原理及其方法实验原理 原代培养（primary culture）从供体取得组织细胞在体外首次培养。细胞分化、药物测试、细胞株建立等 基本方法 组织块法和消化法 a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶，24小时就有细胞向四周游出。简便、易行，适合于来源有限、数量较少的组织做原代细胞培养b.消化法 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等），形成单个细胞或细胞团 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组织选择胰蛋白酶 对骨、前列腺、癌组织等纤
2、维多、较硬的组织可用胶原酶 短时间内可获得大量活细胞主要实验器材 培养箱 二氧化碳恒温箱，5CO2，37，保持湿度，消毒灭菌。倒置显微镜 可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板，带拍摄等功能。离心机 普通离心机（5004000rpm），高速离心机（100015000），冷冻离心机等 （离心力转换成转速：g 1.118r2105）超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间 橡胶、塑料、药品15，金属20 培养瓶 玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199
3、培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）其它常用液 消化液 0.25胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胶原酶。消化酶抑制剂 0.10.5大豆胰酶抑制剂 NaHCO3溶液 常用浓度7.4、5.6、3.7 HEPES溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）终浓度1050 mmol/L 抗生素液 青霉素和链霉素二者的终浓度都达到100U/ml主要实验准备工作一、培养用具的清洗 浸泡 清水浸泡数小时，新玻璃器皿泡5稀盐酸12h以上（中和表面碱性物质）洗刷 洗洁精、软毛刷，轻刷、多次、彻底 浸酸（由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制）灌满，6h以上，最好
4、过夜，去污好 冲洗 充分，灌满-倒出10次以上，最后蒸馏水冲23次，烘干、包装。胶塞和塑料用品清洗 清水浸泡后，2NaOH溶液煮沸10min,自来水冲洗、晾干，1稀盐酸浸泡30min,自来水冲洗，双蒸水冲3次，晾干、包装。二、物品包装 同类物品包装一起，大小合适，包扎紧凑，多层包装，写上标签三、消毒 器具常用压力蒸汽灭菌 掌握时间：煮沸1020min 试剂消毒 无机试剂可用压力蒸汽灭菌（插57针头）有机试剂过滤除菌，常用0.22m 超净工作台 紫外灯照射30min以上 培养室 紫外灯照射23h/天操作步骤1.取材 75酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 PBS溶液洗涤3次 去除液体后，剪碎成12mm3小块2.消化 加58倍组织量的胰蛋白酶溶液 转移到离心管内，加盖 37水浴15min，每5min摇晃1次 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM3.过滤 用400目不锈钢筛网过滤 收集滤液于离心管4.离心 平衡、离心5min，10001500 rpm 去上清，加PBS，混匀，离心（同上）重复上一步5.接种 去上清，加35ml培养基，混匀，接种于培养瓶 加培养基35mm深，盖紧盖，观察细胞密度6.培养 放入培养箱，2天后观察，换液。
