1、选修选修1 生物技术实践生物技术实践生物技术（生物工程）概述生物技术（生物工程）概述反应反应器器生物生物一、概念一、概念物料物料产品产品P3反应器反应器产品产品酵母菌酵母菌酒酒醋杆菌醋杆菌醋醋转基因的大肠杆菌转基因的大肠杆菌干扰素干扰素植物愈伤组织植物愈伤组织试管苗试管苗青霉菌青霉菌青霉素青霉素羊羊人乳人乳兔兔异种蛋白的抗体异种蛋白的抗体鸡胚鸡胚病毒病毒分离的酶分离的酶基因基因举例举例P3二、生物技术的内容二、生物技术的内容（按历史进程划分）（按历史进程划分）反应器为反应器为微生物微生物（天然或改造过的），产品为发酵（天然或改造过的），产品为发酵食品或药物（如人源干扰素、胰岛素、白细胞介素、食
2、品或药物（如人源干扰素、胰岛素、白细胞介素、生长因子等）。生长因子等）。发酵工程发酵工程细胞工程细胞工程技术名称技术名称应用应用植物细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物组织培养花粉培养、原生质花粉培养、原生质体培养体培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交白菜白菜甘蓝甘蓝动物细胞工程动物细胞工程细胞培养细胞培养皮肤细胞培养皮肤细胞培养细胞融合细胞融合人工授精人工授精单克隆抗体单克隆抗体获得抗体获得抗体胚胎移植胚胎移植试管婴儿试管婴儿核移植核移植克隆羊克隆羊P3植物组织培养再分化脱分化愈伤组织外植体试管苗植株原理？原理？植物细胞的全能性植物细胞的全能性根本原因？根本原因？细胞中具有全套遗传物质细胞中具有
3、全套遗传物质记录记录植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B原生质体原生质体A原生质体原生质体B原生质原生质体融合体融合杂种细胞杂种细胞组织培养组织培养杂种植株杂种植株去细胞壁去细胞壁纤维素酶、纤维素酶、果胶酶果胶酶化学法化学法物理法物理法想一想，若只考虑两想一想，若只考虑两两融合，会产生多少两融合，会产生多少种结果？种结果？原理？原理？膜的流动性膜的流动性记录记录植物体细胞杂交的植物体细胞杂交的优点优点克服植物克服植物远缘杂交不亲和的远缘杂交不亲和的障碍障碍植物组织培养是植物组织培养是基础技术基础技术取取材少，培养周期材少，培养周期短，便于自动化短，便于自动化管理，属
4、下游技管理，属下游技术术动物动物胚胎或幼龄胚胎或幼龄动物的组织、器官动物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶（分解粘连蛋白）（分解粘连蛋白）10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代有限细有限细胞系胞系无限细无限细胞系胞系?遗传物遗传物质质未改未改变变遗传物质遗传物质改变改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。过程贴壁生长接触接触抑制抑制分装分装记录记录多莉多莉克隆猴克隆猴绵羊绵羊B乳腺
5、细胞核乳腺细胞核融合卵融合卵绵羊绵羊C子宫子宫多莉多莉植入植入植入植入生生长长克克隆隆多多莉莉羊羊示示意意图图取出取出未受精卵未受精卵去核去核体外胚胎发育体外胚胎发育绵羊绵羊A细胞核移植胚胎移植记录记录蛋白质工程蛋白质工程改变个别改变个别氨基酸氨基酸来改变蛋白质性质来改变蛋白质性质酶工程酶工程基因工程基因工程将将目的基因目的基因导入导入受体细胞受体细胞，使之扩增（克隆）和表达，使之扩增（克隆）和表达（属上游工程）（属上游工程）基基因因工工程程（重组（重组DNA技术）技术）P6实施基因工程的实施基因工程的4个条件：个条件：工具酶工具酶限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶等连接酶等基因
6、的分离基因的分离基因的载体基因的载体细菌或酵母的细菌或酵母的质粒质粒、病毒、病毒DNA 等等受体受体微生物、动物、植物细胞微生物、动物、植物细胞P67PCR扩增，电泳法分离扩增，电泳法分离限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 EcoRI：GAATTC CTTAAG P5黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端磷酸二脂键磷酸二脂键磷酸二脂键磷酸二脂键氢键氢键基因载体（运载体）基因载体（运载体）具备的条件？具备的条件？1.能够在宿主细胞中自主能够在宿主细胞中自主复制复制；2.具有具有限制酶的切点限制酶的切点（与外源基因连接（与外源基因连接)；3.具有具有抗性基因抗性基因（便于筛选）（便于筛选）4.能启动外源基
7、因的转录和翻译能启动外源基因的转录和翻译 质粒、噬菌体、动植物病毒质粒、噬菌体、动植物病毒P7提取提取方法方法基因文库基因文库人工合成法人工合成法重组重组方法方法同种限制酶同种限制酶DNA连接酶连接酶导入导入方法方法侵染法侵染法人工法人工法表达表达方法方法利用标记基因利用标记基因决定的性状决定的性状相应蛋白质相应蛋白质的合成（性的合成（性状表现）状表现）记录记录筛选筛选方法方法三、生物技术高速发展的因素：三、生物技术高速发展的因素：1技术密集型产业，用人少、产值高、利润丰。技术密集型产业，用人少、产值高、利润丰。2生产规模小，节约了人力、物力和能源。生产规模小，节约了人力、物力和能源。3市场广
8、阔，涉及医药卫生、环保、化工、农业等。市场广阔，涉及医药卫生、环保、化工、农业等。4生产工艺简单。生产工艺简单。5生产周期短。生产周期短。6投资少。投资少。7环境污染小。环境污染小。第一部分第一部分 微生物的利用微生物的利用实验实验1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离知识内容：知识内容：1、什么是微、什么是微生物生物2、细菌扩大培、细菌扩大培养的操作和原理养的操作和原理3、细菌分离的、细菌分离的操作和原理操作和原理4、灭菌的操、灭菌的操作和原理作和原理无细胞结构无细胞结构：病毒病毒有细胞结构有细胞结构真核生物真核生物微生物微生物细菌细菌(如大肠杆菌如大肠杆菌)放线菌放线菌蓝细菌蓝细菌真
9、菌真菌：霉菌、酵母菌、霉菌、酵母菌、单细胞藻类、单细胞藻类、单细胞动物单细胞动物等等原核生物原核生物什么是微生物什么是微生物P18（结构简单（结构简单形体微小）形体微小）大多对人类有利大多对人类有利细菌培养和分离中的一些概念和原理细菌培养和分离中的一些概念和原理1、大肠杆菌、大肠杆菌革兰氏阴性、原核、兼性厌氧、在肠道中一般无害。革兰氏阴性、原核、兼性厌氧、在肠道中一般无害。（革兰氏染色法：将细菌分成两大类（革兰氏染色法：将细菌分成两大类革兰氏阳性菌和革革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，与细胞壁成分和厚度有关）兰氏阴性菌，与细胞壁成分和厚度有关）2、LB培养基培养基通用的细菌培养基，含细菌所需的基础成
10、分。通用的细菌培养基，含细菌所需的基础成分。3、液体、固体培养基、液体、固体培养基从成分看从成分看从物理性质看从物理性质看常使用琼脂作凝固剂常使用琼脂作凝固剂,液体培养基用于细菌液体培养基用于细菌扩大培养扩大培养，固，固体培养基则用于细菌的体培养基则用于细菌的划线分离划线分离。P194、分离细菌的方法、分离细菌的方法划线分离划线分离涂布分离涂布分离P1920从末端取样划线，以期获从末端取样划线，以期获得单个细菌。操作简单得单个细菌。操作简单 先稀释再用刮刀涂布，单先稀释再用刮刀涂布，单个细菌更容易分开，可用个细菌更容易分开，可用来计数。操作复杂来计数。操作复杂 5、菌落、菌落一个菌体经分裂，子
11、细胞聚集在一起，形成一个菌体经分裂，子细胞聚集在一起，形成的一个的一个种群种群。不同菌落有不同的色泽、形状、光滑度，可用来鉴别菌种不同菌落有不同的色泽、形状、光滑度，可用来鉴别菌种灭菌操作的方法及原理灭菌操作的方法及原理要求要求方法方法原理原理目的目的各种器皿必各种器皿必须无菌须无菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1200、15min15min高温高压下酶失活高温高压下酶失活杀死一杀死一切微切微生物、生物、孢子、孢子、芽孢芽孢等等各种培养基各种培养基必须无菌必须无菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1200、15min15min同上同上有葡萄糖时有葡萄糖时90、30min30min防止葡萄糖分解碳防止葡萄糖分解
12、碳化化有易分解的物质时（如尿素）有易分解的物质时（如尿素）用用G6玻璃砂漏斗过滤玻璃砂漏斗过滤G6孔径最小，细孔径最小，细菌不能滤过菌不能滤过操作过程必操作过程必须无菌须无菌接种环用火焰灼烧法灭菌接种环用火焰灼烧法灭菌高温下酶失活高温下酶失活操作空间（超净台）用紫外操作空间（超净台）用紫外线灭菌线灭菌破坏细胞内破坏细胞内DNA（人远离）（人远离）操作者衣着和手用酒精灭菌操作者衣着和手用酒精灭菌乙醇使蛋白质变性乙醇使蛋白质变性操作时应在火焰旁进行操作时应在火焰旁进行无菌区无菌区器皿的壁上不能沾有培养基器皿的壁上不能沾有培养基易污染易污染P2021接种的过程接种的过程灭菌灭菌拔塞拔塞冷却冷却并取并
13、取菌种菌种掀盖掀盖并划并划线线实验步骤实验步骤（称量、溶化、（称量、溶化、调调PH、分装、加塞、包扎）、分装、加塞、包扎）配制配制LB培养基培养基(液体和固体液体和固体)灭菌（高压蒸汽法）灭菌（高压蒸汽法）倒平板、摆倒平板、摆斜面斜面（固体平板冷却后，要将平板倒置，防水珠滴入，（固体平板冷却后，要将平板倒置，防水珠滴入，试管斜面可增大接种面积）试管斜面可增大接种面积）接种到液体培养基接种到液体培养基（摇床上（摇床上3712h，扩大培养）扩大培养）划线接种到固体培养基划线接种到固体培养基划线接种到斜面上划线接种到斜面上（4 冰箱，冰箱，保存菌种，试管斜面口小，不易污染）保存菌种，试管斜面口小，不
14、易污染）（倒置，（倒置，37 1天，天，分离细菌分离细菌）P2223讨论：讨论：1、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需要冷却到50度左右，才能用来倒平板，你度左右，才能用来倒平板，你用什么方法来估计培养基的温度？用什么方法来估计培养基的温度？2、为什么要使试管口通过火焰？、为什么要使试管口通过火焰？3、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4、在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅到皿盖与皿身之间、在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅到皿盖与皿身之间的部位，这个平板还能用吗？的部位，这个平板还能用吗？5、在灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再划线？、在灼烧接种环
15、后，为什么要等其冷却后再划线？6、第二次划线为什么要从上一次划线的末端开始？、第二次划线为什么要从上一次划线的末端开始？7、无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污、无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？染外，还有什么目的？手模估计手模估计灼烧灭菌灼烧灭菌防水珠滴入培养基防水珠滴入培养基不用不用防高温杀死菌种防高温杀死菌种获取单一菌种获取单一菌种避免实验员被感染避免实验员被感染例题：例题：1、下面对发酵过程中灭菌的理解不正确的是、下面对发酵过程中灭菌的理解不正确的是 A消灭一切微生物消灭一切微生物 B消灭杂菌消灭杂菌 C培养基和发酵设备都必须灭菌培
16、养基和发酵设备都必须灭菌 D灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B2、酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡、酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡 萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是 A细胞会吸水膨胀细胞会吸水膨胀 B细胞会严重失水细胞会严重失水 C改变了酵母菌的改变了酵母菌的PH D葡萄糖不是酵母菌的营养葡萄糖不是酵母菌的营养物质物质B3、下列是有关细菌的实验：、下列是有关细菌的实验：（1）大肠杆菌的培养和分离所用的培养基从物理性质上）大肠杆菌的培养和分离所用的培养基从物理性质上分别属于分别属于 、.液体培养基液体培养基固体培养
17、基固体培养基（2）常用稀释涂布平板法来测定大肠杆菌的数目，该方）常用稀释涂布平板法来测定大肠杆菌的数目，该方法中实际统计的是培养基上的法中实际统计的是培养基上的 的数目。的数目。（3）计数时所用的培养基是固体培养基，常用的灭菌方）计数时所用的培养基是固体培养基，常用的灭菌方法是法是 。接种时的方法为。接种时的方法为 。菌落菌落高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法涂布分离法涂布分离法4、对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养、并利用纯化技、对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养、并利用纯化技术得到单菌落的菌种。请回答下列问题：术得到单菌落的菌种。请回答下列问题：（1）LB培养基主要是用培养基主要是用 和酵母提取物来
18、配和酵母提取物来配制，为调节渗透压，要加入一定量的制，为调节渗透压，要加入一定量的 。为进行。为进行大肠杆菌的分离，还要加入大肠杆菌的分离，还要加入 配制成固体培养基。配制成固体培养基。（2）获得纯净微生物的关键是）获得纯净微生物的关键是 防防止止 ，为此，为此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用器皿和培养基一般采用 法灭菌，接种环采法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌，接种过程必须在用灼烧法灭菌，接种过程必须在 旁操作。旁操作。蛋白胨蛋白胨NaCl杂菌污染杂菌污染火焰火焰琼脂琼脂高压蒸汽高压蒸汽（3）菌种的扩大培养
19、一般采用）菌种的扩大培养一般采用 培养基，培养温度培养基，培养温度为为 。菌种的分离一般采用。菌种的分离一般采用 法分离，并将法分离，并将培养皿以培养皿以 状态放置于恒温箱中，得到的纯化菌种状态放置于恒温箱中，得到的纯化菌种在在 温度下保存。温度下保存。液体液体37划线分离划线分离倒置倒置45、下表表示在不同培养基中细菌的生长繁殖情况。、下表表示在不同培养基中细菌的生长繁殖情况。（E、F、G、H、I、J、K、M为培养基的成分，为培养基的成分，“+”表示生长，表示生长，“”表示不生长），请分析下列表示不生长），请分析下列哪种物质是细菌无法合成的。哪种物质是细菌无法合成的。培养基培养基成分成分A、
20、B、CA、B、C、I、MA、B、C、H、KA、B、C、M、JA、B、C、I、KA、B、C、H、JA、B、C、K、M生长状生长状态态+A、H B、I C、K D、MC6、实验室有两个菌种：、实验室有两个菌种：胱氨酸依赖型细菌胱氨酸依赖型细菌（无胱氨酸不能生长）、（无胱氨酸不能生长）、甲基营养细菌甲基营养细菌（只能利用甲醇、甲烷作碳源），但试管上标签脱落。（只能利用甲醇、甲烷作碳源），但试管上标签脱落。某同学的鉴别思路是配制个培养基，只接种其中的任一菌种，根据某同学的鉴别思路是配制个培养基，只接种其中的任一菌种，根据生长状况将其鉴别出来，另一种自然鉴别出来。请根据这一思路完生长状况将其鉴别出来，另
21、一种自然鉴别出来。请根据这一思路完成实验方案成实验方案.（提示：（提示：可添加不同的营养物作为实验变量）可添加不同的营养物作为实验变量）实验步骤：实验步骤：第一步：在两个菌种的试管上分别记第一步：在两个菌种的试管上分别记1、2。第二步：配制两种培养基：第二步：配制两种培养基：A:，B：.第三步第三步:将将1号菌种分别接种到两种培养基中。号菌种分别接种到两种培养基中。结果分析结果分析:含胱氨酸而不含甲基营养含胱氨酸而不含甲基营养不含胱氨酸而含甲基营养（不含胱氨酸和甲基营养）不含胱氨酸而含甲基营养（不含胱氨酸和甲基营养）若若A中能长，中能长，B中不能长，则中不能长，则1为胱氨酸依赖型，为胱氨酸依赖
22、型，2为甲基营养型。为甲基营养型。若若A中不能长，中不能长，B中能长，（在中能长，（在AB中都不能长）中都不能长）则则1为甲基营养型，为甲基营养型，2为胱氨酸依赖型。为胱氨酸依赖型。大肠杆菌模型（原核细胞）大肠杆菌模型（原核细胞）实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物分离微生物的方法分离微生物的方法平板划线分离法平板划线分离法稀释平板涂布法稀释平板涂布法选择培养基培养法选择培养基培养法（添加或不加某些特殊化合物，筛选出特异性的菌种）（添加或不加某些特殊化合物，筛选出特异性的菌种）对培养基的处理对培养基的处理筛选出的目的菌筛选出的目的菌加青霉素（抗生素）加青霉素（抗生素）抗
23、青霉素（抗生素）的菌种抗青霉素（抗生素）的菌种加尿素为唯一氮源加尿素为唯一氮源含脲酶的菌种（能利用尿素）含脲酶的菌种（能利用尿素）不加任何氮源不加任何氮源固氮菌（能利用固氮菌（能利用N2）不加任何碳源不加任何碳源自养菌（能利用自养菌（能利用CO2）记录记录实验原理实验原理1、尿素又称脲，是蛋白质降解的产物，大量尿素、尿素又称脲，是蛋白质降解的产物，大量尿素会引起土壤板结，有些细菌含会引起土壤板结，有些细菌含脲酶脲酶，可以降解尿，可以降解尿素为氨。素为氨。2、配制、配制尿素固体培养基尿素固体培养基（尿素为唯一氮源），用以（尿素为唯一氮源），用以分离出以尿素为氮源的微生物分离出以尿素为氮源的微生物
24、3、稀释涂布平板法稀释涂布平板法，用以统计微生物的数目，用以统计微生物的数目4、酚红指示剂遇碱性呈、酚红指示剂遇碱性呈红色红色（尿素中性，氨偏碱性）（尿素中性，氨偏碱性）P25实验目的实验目的1、用、用尿素固体平板培养基分离尿素固体平板培养基分离含脲酶的微生物。含脲酶的微生物。2、观察、观察酚红显色酚红显色情况验证脲酶微生物的存在。情况验证脲酶微生物的存在。3、统计统计脲酶微生物的数量。脲酶微生物的数量。实验流程实验流程配制全营养配制全营养LB固体培养基固体培养基和尿素固体培养基和尿素固体培养基（注意尿素的灭菌法，（注意尿素的灭菌法，加琼脂糖和酚红）加琼脂糖和酚红）倒平板倒平板（在超净台的酒精
25、灯旁）（在超净台的酒精灯旁）制备不同浓度的细菌悬液制备不同浓度的细菌悬液（取样时尽量只取悬液）（取样时尽量只取悬液）涂布分离涂布分离（注意对照和重复，在酒（注意对照和重复，在酒精灯旁操作）精灯旁操作）培养培养（培养皿倒置，（培养皿倒置，37,2448h）观察比较菌落数观察比较菌落数P2627实验中涉及到的一些问题实验中涉及到的一些问题1、哪些土壤中含这些以尿素为氮源的微生物较多？、哪些土壤中含这些以尿素为氮源的微生物较多？2、为什么用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？、为什么用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？4、可用什么指标判断不同土壤中选择出的这些微生物对尿素分、可用什么指标判断不同土壤中选择出的
26、这些微生物对尿素分解能力的高低？解能力的高低？5、若稀释涂布分离结果，菌落数超过可数范围，怎么办？、若稀释涂布分离结果，菌落数超过可数范围，怎么办？6、实验中的重复性原则和对照原则分别有什么作用？、实验中的重复性原则和对照原则分别有什么作用？未硬化，动物排泄物较多处未硬化，动物排泄物较多处避免混合物琼脂中混有含氮物质，以保证尿素是唯一氮源避免混合物琼脂中混有含氮物质，以保证尿素是唯一氮源3、分离出的一定是利用尿素的细菌吗？、分离出的一定是利用尿素的细菌吗？不一定，也可能有利用氮气的固氮菌不一定，也可能有利用氮气的固氮菌根据酚红显色的深浅根据酚红显色的深浅继续加大细菌的稀释度继续加大细菌的稀释度重复是为了避免实验中的偶然因素，增加说服力。对照是为了排重复是为了避免实验中的偶然因素，增加说服力。对照是为了排除无关因素的干扰，以确保实验的准确性。除无关因素的干扰，以确保实验的准确性。P28
