1、抗生素的质量分析抗生素的质量分析与研究与研究上海市食品药品检验所刘浩目录目录 抗生素（微生物药物）的定义和组成抗生素（微生物药物）的定义和组成 抗生素结构的特点抗生素结构的特点 抗生素质量的宏观分析抗生素质量的宏观分析 抗生素质量的微观分析抗生素质量的微观分析 抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 抗生素质量的综合分析抗生素质量的综合分析 抗生素质量分析的分类介绍抗生素质量分析的分类介绍 抗生素质量分析的展望抗生素质量分析的展望抗生素（微生物药物）的定义和组成抗生素（微生物药物）的定义和组成 抗生素（antibiotic）（1944年）：微生物在其代谢过程中所产生的具有抑制其他种类微生物生
2、长及活动甚至杀灭其他种类微生物的化学物质 1950s：抗菌素；青霉素类，链霉素类，四环素类 1980s：在低微浓度下有选择地抑制或影响其他种类生物机能并在微生物生命过程中产生的具有生理活性的次级代谢产物及其衍生物。抗肿瘤类；抗寄生虫类；磺胺类，酮康唑类；芬净类，磷霉素类，氯霉素类，单环类（氨曲南）和碳青霉烯类（硫霉素）抗生素（微生物药物）的定义和组成抗生素（微生物药物）的定义和组成 1990s：微生物药物（microbial medicine）：由微生物在其生命活动过程中产生的在低微浓度下具有生理活性的次级代谢产物及其衍生物 具有抗微生物感染、抗肿瘤和抗病毒作用的传统抗生素 具有调节原核生物和
3、真核生物生长和复制等生理功能的免疫调节剂、受体拮抗剂或激动剂、抗氧化剂、特异性酶抑制剂如部分他汀类调节血脂药：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀抗生素结构的特点抗生素结构的特点 纯度一般较化学药品低：同系物多、异构体多、多组分、多晶型、降解产物多 发酵工艺中可变性较大，可控性较低：生产菌种不同，代谢产物差异，活性组分易发生变异，提取工艺不同 活性组分易发生变异，稳定性一般较化学药品差：分子结构中通常含有较活泼的化学结构，该结构为抗生素的活性基团并易受外界环境的影响而发生变化 杂质谱复杂且难以预测抗生素的耐药和研发抗生素的耐药和研发“限抗令限抗令”：50种（三级），种（三级），35种（二级）
4、；细种（二级）；细菌耐药菌耐药“模式模式”的改变和的改变和“加剧加剧”2011.4.7：WHO“世界卫生日世界卫生日”主题：细菌耐药性主题：细菌耐药性 20012011：FDA：3/12；达托霉素（脂肽类）、；达托霉素（脂肽类）、瑞他帕林瑞他帕林（截短侧耳素类）、菲达霉素（新型大截短侧耳素类）、菲达霉素（新型大环类）环类）近近30个候选药物：个候选药物：针对多药耐药革兰阴性菌者少针对多药耐药革兰阴性菌者少 抗菌药的生命周期短，利润低，研发难度大抗菌药的生命周期短，利润低，研发难度大 抗生素的研发：国外：受市场驱动，仅抗生素的研发：国外：受市场驱动，仅GSK和和AstraZeneca；国内：；国
5、内：“十一五十一五”、“十二五十二五”“抗耐药菌创新药物研发抗耐药菌创新药物研发”专题专题抗生素质量的宏观分析抗生素质量的宏观分析 利用各种分离分析手段对各种抗生素的纯度（主要活性成分及其有关组分）进行全面剖析，以达到对它们的本质有一个宏观的了解 通过对纯度和组分的控制防止由于生产菌种和生产工艺的不同照成品种的混淆或假冒现象的发生抗生素质量的宏观分析抗生素质量的宏观分析 去甲万古霉素，万古霉素：NMR鉴别 万古霉素B：BP/ChP：93.0%；USP：85.0%制霉素：制霉菌素A3+多真菌素B+制霉菌素A1；效价和稳定性均较高 制霉菌素：制霉菌素A1 HPLC、UV、IR、NMR、MS抗生素质
6、量的微观分析抗生素质量的微观分析杂质分析杂质分析 杂质的定义：任何影响药物纯度的物质。药物中所含有的没有治疗作用、可能影响药物的稳定性和疗效，甚至是对人体健康有害的物质 杂质研究的内容：具体工艺及产品特点，杂质的来源及结构；合适的分析方法；综合药学、药理毒理及临床研究结果，确定合理的杂质限度 抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 利用生物学、物理学、药理学和化学等相关学科的经典的或现代的技术和方法按照指定的质量标准进行依法检验 性状、鉴别、检查和含量测定 性状：粉末的颜色；晶型：氨曲南、利福平等 鉴别：红外鉴别：多晶型，转晶；手性构型的鉴别；成盐的酸根的鉴别（阿奇霉素盐的种类的选择）；TL
7、C法和HPLC法抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析熔点：多组分，熔距宽；红霉素转晶；氯霉素比旋度：组分控制：红霉素A（-78），红霉素C（-65-62），ChP：-78-71；手性异构体纯度的控制：磷霉素：异构体无抗菌活性；磺苄西林：D()构型的抗菌活性为L()构型的抗菌活性的48倍（不同厂家产品的异构体比例不同）抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 水分或干燥失重：游离水，结晶水 头孢噻肟钠：ChP：6.0%，国外药典：3.0%水活度的分析结合加速稳定性实验：水分含量低于3.0%时，可以基本消除水分对头孢噻肟钠稳定性的影响 酸碱度（临床、稳定性、澄清度）抗生素质量的常规分析抗生素质
8、量的常规分析 溶液的澄清度：酸中不溶性物质（头孢噻肟钠）；胶塞等包材中的释放物与药物的相互作用 溶液的颜色：分离方法不能检出的有色杂质（头孢呋辛钠、头孢曲松等）炽灼残渣和重金属：无机杂质；铜和锌可促使-内酰胺开环 杂质吸光度：盐酸多西环素（490nm）：检查有色蛋白类杂质、异构体和降解物；两性霉素A抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 抽针试验：苄星青霉素（青霉素的二苄基乙二胺盐）：混悬液，5号针头（防止临床使用时针头被堵塞）晶体的形状及其粒径与临床用药安全相关：肌注后由于颗粒太大引起局部组织红肿等刺激性反应 针头堵塞的原因：晶粒的形状、大小、分布不匀、晶粒之间的静电引力和凝聚等 制备过程
9、中应避免形成针状结晶，以粉碎至平均粒径约为150m的板状结晶为佳残留溶剂ICH：按照对人体和环境的危害程度分为四类并制定了限度标准中国药典：在几乎所有抗生素原料药项下均按其生产工艺制定残留溶剂检查工艺不同，溶媒不同，同一品种可能有几十种溶媒；以类别为单元，涵盖同类药品可能涉及的有机溶剂；ChP采用同一色谱条件顶空进样：标准加入法排除基质干扰-内酰胺类抗生素中2-乙基己酸的测定 加2-乙基己酸钠（或碳酸氢钠或醋酸钠）成盐、结晶 对人体和环境有潜在的毒害性 头孢噻吩钠、头孢呋辛钠、苯唑西林钠等 GC法：13种人用-内酰胺类抗生素和2种-内酰胺酶抑制剂；限度规定为0.3%0.8%33%盐酸溶液溶解，
10、环己烷提取，上层环己烷溶液进样分析 有些品种的样品不能完全溶解-内酰胺类抗生素中-萘酚的测定 头孢菌素可选择性的与-萘酚络合并从水溶液中沉淀出来（头孢菌素极少受到降解）；滤过分离；混悬液酸化，去络合，有机溶剂萃取；结晶 产品中-萘酚的残留量差异较大 每天的允许摄入量为2mg/day，如成人每天服用抗生素的最高剂量为4g，则-萘酚的最大残留量应低于100 ppm ChP的HPLC法：头孢克洛、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄等抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 异常毒性：非药品本身引起的毒性反应；反映不同来源产品的质量差异 USP1990不再收录 热原或细菌内毒素：剂量；假阳性和假阴性 细菌
11、内毒素检查的假阳性问题：普通鲎试剂与内毒素的反应是非特异性的，其凝集系统中存在着G因子反应旁路，一些非内毒素物质可能含有可以活化鲎试剂G因子的成分，从而激活鲎试剂凝集系统中的G因子反应旁路而发生凝集反应，导致细菌内毒素检查的假阳性抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 有关物质 溶出度：与药物生物利用度之间并无绝对的关系；制剂质量控制的一种手段；反映不同产品主药的晶型、粒度处方组成、辅料品种和性质以及制剂工艺的差异 不溶性微粒和可见异物：光阻法：50m以下微粒 降压物质 无菌：微孔滤膜法；青霉素酶灭活法抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 装量差异、片重差异等：可以在一定程度上反映生产工
12、艺的成熟性 含量测定：微生物检定法和理化测定法 阿奇霉素片：含量分布呈明显正态分布，含量均值为96；采用微生物检定法的结果较HPLC法的结果约高为5 微生物检定法：利用抗生素对细菌的杀死或抑制程度作为指标来衡量抗生素的效力 管碟法和比浊法抗生素质量的常规分析抗生素质量的常规分析 理化测定法：滴定法（酸碱、氧化还原、电位）紫外光或荧光吸收法 HPLC-UV法、HPLC-ELSD法（ChP氨基糖苷类）、HPLC-柱后衍生化-UV法（异帕米星）、HPLC-ECD法（BP氨基糖苷类、USP阿奇霉素）GC法（BP大观霉素，BP灰黄霉素，USP克林霉素棕榈酸酯）抗生素中的致敏性杂质抗生素中的致敏性杂质-内
13、酰胺类抗生素过敏反应的研究：致敏性高分子杂质 外源性杂质：蛋白、多肽、多糖等，或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物。如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等 内源性杂质：抗生素的自身聚合产物，即抗生素寡聚物和多聚物的总称凝胶色谱系统的应用凝胶色谱系统的应用 Sephadex G10凝胶色谱系统：色谱柱效低、分离效果差 不能有效分离不同聚合度的聚合物，易受开环物等小分子杂质的干扰 受制剂中辅料的干扰 常用的-内酰胺酶抑制剂与聚合物同时洗脱 无法应用于水溶性差的-内酰胺酯 不能分离碳青霉烯类中的聚合物高效凝胶色谱系统的应用高效凝胶色谱系统的应用 高效Superdex Piptide（葡聚糖交联琼脂糖）凝胶色
14、谱系统 阿莫西林片中不同聚合度的聚合物 美罗培南中聚合物 青霉素V钾颗粒中聚合物 高效TSK 2000SWXL（亲水性多孔硅胶）凝胶色谱系统 ChP:头孢地嗪钠高效凝胶色谱系统的应用高效凝胶色谱系统的应用 高效TSK2500 PWXL（乙烯共聚物）凝胶色谱系统 阿莫两林钠克拉维酸钾片中阿莫西林聚合物的分析 高效TSK Gel G2500 HXL（苯乙烯-二乙烯苯共聚物）疏水凝胶色谱系统 盐酸头孢卡品酯（cefcapene prvoxil hydrochloride）中的聚合物 头孢泊肟酯中的聚合物高效液相色谱系统高效液相色谱系统 指针性杂质：阿莫西林钠、氨苄西林钠 阿莫西林/克拉维酸钾制剂：阿
15、莫西林闭环二聚体为最大杂质且与杂质总量呈一定的相关性 在溶液中，阿莫西林闭环二聚体和二酮哌嗪阿莫西林的含量与各类阿莫西林聚合物含量之和呈一定的相关性生产工艺对氨苄西林钠质量的影响生产工艺对氨苄西林钠质量的影响 生产工艺：溶媒结晶法（杂质水平低，稳定性高）、冷冻干燥法和喷雾干燥法 闭环二聚体杂质：含量与变化与产品的生产工艺有关 溶媒结晶工艺：闭环二聚体含量低且随放置时间的增加增长缓慢 冷冻干燥工艺：闭环二聚体含量高且随放置时间的增加增长迅速水活度的概念水活度的概念 固体中水分子的存在形式可分为自由水和结合水；只有自由水参与各类物理或化学反应；其含量是影响样品稳定性的主要因素 水活度（water
16、activity）：反映的是固体中水与各种非水成分缔合的强度，是样品中所含有的自由水的度量值；反映了样品中直接参与物理化学反应的自由水的含量氨苄西林钠产品的开环二聚体含量氨苄西林钠产品的开环二聚体含量与水活度的关系与水活度的关系 开环二聚体：含量随着样品水活度的增加而增加并在溶媒结晶工艺产品中较高 溶媒结晶的产品：具有较高的自由水含量，易发生水解反应；水活度较大，水解反应易于发生，产生开环二聚体 冷冻干燥的产品：水活度低，不易产生开环二聚体 样品中开环二聚体的含量可以间接反映其水活度的大小盐酸头孢吡肟中盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检测甲基吡咯烷的检测 具有中度急性毒性和明显的致畸变性 BP、
17、USP、JP：非抑制型IC，磺酸基键合硅胶为填充剂 ChP：tITP-CZE和非抑制型IC（羧基键合硅胶为填充剂）IC：须配制含头孢吡肟和NMP的混合溶液进样分析以便确认供试品溶液色谱图中的NMP+峰 盐酸头孢吡肟中盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的甲基吡咯烷的IC检测检测 供试品溶液色谱图中NMP+峰的保留时间较其在NMP对照品溶液色谱图中缩短约10%供试品溶液进样后，大量强保留的荷正电离子占据了部分阳离子交换功能基 固定相在保留强保留的荷正电离子的同时释放了等摩尔量的氢离子，后者对弱保留的荷正电离子起到一种微梯度洗脱的作用盐酸头孢吡肟中盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的甲基吡咯烷的tITP-CZE
18、检测检测 前导离子：高浓度的探针离子（咪唑）终结离子：质子化的头孢比肟和氢离子；质子化的精氨酸 在毛细管前端构建tITP体系：样品自身堆积效应富积NMP+，可大体积进样并避免区带的展宽 操作缓冲液的pH值（4.7）：处于47的安全区间；避免CZE过程中被测组分区带的变形以及氢离子作为同离子对检测灵敏度的降低 检测限和定量限：分别相当于头孢比肟量的0.003%和0.01%MEKC和HPLC检测头孢噻吩钠的杂质谱 某些品牌填料的色谱柱：头孢噻吩峰前端未知杂质峰(ChP对照品)（杂质A）化学药物杂质研究的技术指导原则：各种分离系统均具有一定的局限性，应注意不同原理的分离系统间的相互补充与验证 HPL
19、C与TLC、HPLC与CE、反相HPLC与正相HPLC、反相HPLC与HILIC等 各国药典：TLC或GC 还原型谷胱甘肽：CE(EP/BP)NSOONaOCH3OONHSOH H庆大霉素庆大霉素庆大霉素的RP-IP-HPLC-PED图谱庆大霉素的RP-IP-HPLC-ELSD图谱Analysis of underivatized gentamicin by CE-UV detection卡那霉素的EMMA-CZE图（上）和precapillary-derivatization-CZE图（下）卡那霉素的CZE-C4D电泳图磷霉素：磷霉素：1969年自弗氏链霉菌中发现年自弗氏链霉菌中发现磷霉素氨
20、丁三醇的HPLC图 b d a fosfomycin c e 以山梨酸为探针试剂的tITP-CZE-间接UV法检测淌度小于磷霉素的杂质min99.51010.51111.512Norm.-40-35-30-25-20-15-10-5 DAD1 C,Sig=235,4 Ref=off(LIUHAO00000005.D)DAD1 C,Sig=235,4 Ref=off(LIUHAO00000009.D)DAD1 C,Sig=235,4 Ref=off(LIUHAO00000012.D)以邻苯二甲酸为探针试剂的CZE-间接UV法检测淌度大于磷霉素的杂质min81012141618Norm.-200-
21、150-100-50050100150 DAD1 A,Sig=225,4 Ref=off(LIUHAO00000499.D)DAD1 A,Sig=225,4 Ref=off(LIUHAO00000500.D)复方药物各成分之间的相互作用复方药物各成分之间的相互作用利福霉素类复方药物：异烟肼利福霉素腙制剂辅料与药物的相容性研究制剂辅料与药物的相容性研究 乳糖：半缩醛羟基醛式，可与含有伯胺类结构的化合物发生缩和反应，生成腙与糖脎等衍生物 利福霉素类复方药物：异烟肼与乳糖胶塞与抗生素的相容性研究胶塞与抗生素的相容性研究 注射用抗生素粉针剂溶液的澄清度 五水头孢唑林钠/头孢唑林钠水合物 无定形头孢唑林
22、钠：不溶于水的复合物 瓶间差异，接触时间，大规格 胶塞：材质（覆膜胶塞：四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯，溴化丁基胶塞）；硅油（压盖时的滑动性，跳塞）残留量；清洗方式、水温、水质注射用头孢拉定致血尿不良反应的注射用头孢拉定致血尿不良反应的药理学研究药理学研究 结论：大剂量（高浓度）药物会在肾脏中积聚形成结晶，对肾脏产生一定的化学毒性和物理性损伤；低剂量时，大量不溶性微粒可能引发血尿不良反应；日龄较小的动物更易引发血尿不良反应 浓度越高，不溶性微粒数目就越多 药品的溶解方式宜振荡溶解抗生素质量分析的展望抗生素质量分析的展望 质量源于设计（QbD）的理念：产品的特性和生产工艺参数均是为达到特定的治疗目标科
23、学设计的，而不是对其经验数据的简单总结 根据先进工艺的特点理性地确定工艺异常时各项指标的的限度，并据此阻止采用落后生产工艺的产品上市抗生素质量分析的展望抗生素质量分析的展望 杂质检查：对不同来源的杂质设定不同的限度，控制起始原料的质量、合成工艺的优劣和生产过程 特定杂质：如安全性没有进行过评估，其限度均按通则的要求（ICH）确定 仅从安全性的角度考虑杂质的限度：不考虑生产工艺对微量杂质组分的毒性评价对微量杂质组分的毒性评价 对一些专属性不强，灵敏度不高的动物实验，如小鼠异常毒性试验、溶血试验、刺激试验、过敏试验、降压试验等，通常不宜作为杂质毒性评价的动物模型 药物毒性功能基团的理念：从2009
24、年起，利用斑马鱼胚胎毒性实验评价药物杂质相对于活性成分的相对毒性实施杂质谱控制的基本策略实施杂质谱控制的基本策略对微量杂质组分的毒性快速评价对微量杂质组分的毒性快速评价 加替沙星光降解杂质、头孢噻肟钠诸杂质、利福平诸杂质、阿奇霉素杂质J 利用斑马鱼评价氨基糖苷类抗生素耳毒性的模型（药学学报，2011,46:928）斑马鱼胚胎毒性实验与定量结构性质/活性相关(QSPR/QSAR)分析方法的结合：药品中微量杂质的危险性评估，确定药品杂质的质控限度（中国药事，2011，25：710）抗生素多晶型与抗菌活性的关系抗生素多晶型与抗菌活性的关系晶型：溶解度；溶液中的构象：NMR，拉曼光谱哌拉西林、头孢噻肟
25、、头孢曲松(2011年严重病例报告数排名第一；过敏性休克374例，严重过敏样反应241例，27例死亡病；2012.12：注射用头孢曲松钠安全性问题企业沟通会)大环内酯类（阿奇霉素）林可霉素氨基糖苷类（阿米卡星：注射液：USP/BP：pH3.55.5，ChP：pH4.07.0；生物效价差异显著；辅料；溶液中构象的选择）某些化学全合成药物：溶液中的稳定性抗生素与核糖体的联结抗生素与核糖体的联结 大部分抗生素（利奈唑胺、红霉素、氯霉素和四环素等）通过作用于细菌核糖体而发挥抗菌活性 高分辨率细菌核糖体X-射线晶体技术和生物大分子NMR技术 研究核糖体-抗生素复合物的结构（2009年诺贝尔化学奖）：可从分子水平上理解抗生素的作用机制、构效关系和耐药机制，指导设计新的抗生素多谢！
