1、 1)随机测序随机测序 2)限定测序限定测序 1)基因组文库构建基因组文库构建 2)两端测序两端测序 3)为何要两端测序为何要两端测序1)测序的测序的DNA多聚酶多聚酶;2)测序标记测序标记;3)电泳装置电泳装置;4)测序难点测序难点.目前普遍采用的测序酶为目前普遍采用的测序酶为Sequenase,来自来自T7噬菌体噬菌体同位素标记电泳测序同位素标记电泳测序Sanger测序法测序法:焦磷酸测序技术是一焦磷酸测序技术是一种新的实时种新的实时DNADNA测序测序技术。它在技术。它在DNADNA聚合聚合酶、三磷酸腺苷硫酸酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶磷酸腺苷双
2、磷酸酶4 4种酶的协同作用种酶的协同作用下，使引物延伸聚合下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸.dNTP释放焦磷酸盐释放焦磷酸盐PPiPPi、PPiPPi转换为三磷酸腺转换为三磷酸腺苷（苷（ATPATP）、）、ATPATP产产生荧光信号与生荧光信号与dNTPdNTP和和ATPATP的降解等化学的降解等化学反应偶联起来，检测反应偶联起来，检测结果准确可靠。结果准确可靠。循环循环阵列测序阵列测序-滚环扩增建库滚环扩增建库cyclic-arraysequencing测测序序文文库库构构建建滚环复制滚环复制拷贝扩增拷贝扩增循环循环阵列测序阵列测序-PCR建库建库Polymerase colony
3、,or polony,technologies perform multiplex amplification while maintaining spatial clustering of identical amplicons.In emulsion PCR(ePCR),a waterin-oil emulsion permits millions of noninteracting amplifications within a milliliter-scale volume.Amplification products of individual compartments are ca
4、ptured via inclusion of 1-mm paramagnetic beads bearing one of the PCR primers.Any single bead bears thousands of single-stranded copies of thesame PCR product,whereas different beads bear the products of different compartmentalized PCR reactions.The beads generated by ePCR have highly desirable cha
5、racteristics:high signal density,geometric uniformity,strong feature separation,and a size that is small but still resolvable by inexpensive optics.循环循环阵列阵列测序测序-富集富集与与测序测序芯片芯片制作制作循环循环阵列测序阵列测序焦磷酸测序焦磷酸测序循环循环阵列测序阵列测序碱基读取碱基读取1)1)大肠杆菌基因组测序大肠杆菌基因组测序-图位法图位法2)2)流感嗜血杆菌基因组测序流感嗜血杆菌基因组测序-鸟枪法鸟枪法3)3)果蝇基因组测序果蝇基因组测
6、序-鸟枪法鸟枪法4)4)人类基因组测序人类基因组测序-图位法和鸟枪法图位法和鸟枪法4)4)拟南芥基因组测序拟南芥基因组测序图位法图位法5)5)水稻基因组测序水稻基因组测序-图位法和鸟枪法图位法和鸟枪法大肠杆菌大肠杆菌C区测序采取了分割染色体区测序采取了分割染色体DNA的技术的技术,将切离的一段染色体将切离的一段染色体DNA与人工插与人工插入的复制载体整合入的复制载体整合,获得可独立扩增的克隆获得可独立扩增的克隆片段用于鸟枪法测序片段用于鸟枪法测序.注注:线虫为单性线虫为单性(X或或Y)或雌雄同体或雌雄同体(XX),Y染色体未测序染色体未测序.构建了两套基因组文库构建了两套基因组文库:1)1.6
7、-2 kb大小插入子基因组文库大小插入子基因组文库.2 kb大小插大小插 入子可减少扩增时的变异率入子可减少扩增时的变异率.此外此外,2 kb大小大小 降低了克隆片段含有完整基因的可能性降低了克隆片段含有完整基因的可能性,有有 些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的.2)15-20 kb大小插入子文库大小插入子文库,用于支架搭建用于支架搭建.上述两套基因组文库的克隆测序均为两端上述两套基因组文库的克隆测序均为两端 测序测序.1)流感嗜血杆菌基因组总长流感嗜血杆菌基因组总长:1.8 Mb2)测序覆盖率计算测序覆盖率计算,P定义为丢失的概率定义为丢失的概率.P0=
8、e-m,m为覆盖面为覆盖面,即当量数即当量数 若若m=1 P0=e-1=0.37 若若m=5 P0=e-5=0.0067=0.67%若若m=10 P0=e-10=4.5 x 10-5=0.000045=0.0045%3)两端测序两端测序,每次有效的可读顺序为每次有效的可读顺序为460 bp,每个克隆为每个克隆为920 bp.4)随机挑选质粒载体克隆随机挑选质粒载体克隆9600个个,载体克隆载体克隆500个个.两端测序两端测序 共获得测序总长共获得测序总长为为8.84 x 106,覆盖面约覆盖面约5,P0=e-5=0.67%.5)预计丢失的顺序预计丢失的顺序为为L x e-m=1.8 Mb x
9、0.0067=1.25 x 104 bp.6)空隙长度为空隙长度为:L/n=1.8 Mb/(9600 x 2)(L为基因组总长为基因组总长,n为测为测序数序数)=100 bp.7)空隙数为空隙数为:1.25 x 104bp/100 bp=128 测序结果略高于预计结果测序结果略高于预计结果,即即42个物理间隙和个物理间隙和98个顺序间隙个顺序间隙.测序后将测序后将DNA顺序进行组装顺序进行组装,会发现存在不会发现存在不连续的区段连续的区段.它们产生于它们产生于:1)因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序序,仍存在于克隆文库中仍存在于克隆文库中,这类间隙称为这类间
10、隙称为顺序间隙顺序间隙.2)因克隆载体自身的限制或因克隆载体自身的限制或DNA顺序特殊顺序特殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未能的组成等原因造成某些顺序丢失或未能克隆克隆,这类间隙称为这类间隙称为物理间隙物理间隙.1)1)两端测序的结果称为读序两端测序的结果称为读序(read),(read),每个读序每个读序 长约长约400 bp400 bp.2)2)在在DNADNA顺序组装前顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读由自动测序仪给出的每个读序都必须经序都必须经PhredIIPhredII软件处理软件处理,以确定给出的以确定给出的顺序质量与可靠性顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可这一步为顺序认可(c
11、alling for).(calling for).3)3)流感嗜血杆菌基因组测序共组装了流感嗜血杆菌基因组测序共组装了2430424304个片个片段段,建立了建立了140140个重叠群个重叠群(contig(contig).).根据某些克根据某些克隆跨越不同的隆跨越不同的contigcontig,再合并为再合并为4242个支架个支架(scaffold).(scaffold).4)4)整个组装的基因组顺序存在整个组装的基因组顺序存在4242个物理间隙个物理间隙,98,98个顺序间隙个顺序间隙.基因组全长基因组全长1830137bp(1.8 Mb).1830137bp(1.8 Mb).1)1)B
12、ACBAC末端顺序末端顺序(BAC-end sequenced)(BAC-end sequenced)一个一个BACBAC克隆插入片克隆插入片段两端的已测序的顺序段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序不包括内部顺序.可用于确定可用于确定BACBAC的排列方向以及重叠群的排列方向以及重叠群(contig(contig)在支架在支架(scaffold)(scaffold)中的排中的排列方向列方向.2)2)叠连群叠连群(contig(contig)一群相互重叠的克隆或一群相互重叠的克隆或DNADNA顺序顺序,可以是可以是草图顺序或精确顺序草图顺序或精确顺序(finished),(finished),包
13、括连续的包括连续的(内部无间内部无间隙隙)或不连续的或不连续的(内部含间隙内部含间隙)DNA)DNA顺序顺序.3)3)草图顺序草图顺序(draft sequence)(draft sequence)人类基因组测序计划定义人类基因组测序计划定义为为经经PhredPhred Q20 Q20软件认可覆盖测序克隆片段软件认可覆盖测序克隆片段3-43-4倍的倍的DNADNA顺序顺序.含间隙或无间隙含间隙或无间隙,排列方向和位置未定排列方向和位置未定.4)4)完成顺序完成顺序(finished sequence)(finished sequence)顺序差错率顺序差错率(错误碱基数错误碱基数)低于低于0.
14、01%0.01%的的DNADNA序列序列,排列方向确定排列方向确定,内部不含间隙内部不含间隙,一一般测序覆盖率在般测序覆盖率在8-108-10个当量个当量.5)5)支架支架(scaffold)(scaffold)一组已锚定在染色体上的叠连群一组已锚定在染色体上的叠连群,内部内部含间隙或不含间隙含间隙或不含间隙.引自引自NCBI,NCBI,Revised November 6,2003Revised November 6,2003 1)以以BAC克隆重叠群为基础的测序克隆重叠群为基础的测序2)全基因组鸟枪法测序全基因组鸟枪法测序1)由自动测序仪记录的测序顺序经由自动测序仪记录的测序顺序经Phre
15、d Q20 软件判断采用软件判断采用.1)筛查过滤重复顺序筛查过滤重复顺序:如如rRNA基因基因,转座子等转座子等2)重叠顺序组装重叠顺序组装:两段顺序重叠的认可标准为两段顺序重叠的认可标准为,至少至少40 bp的重叠的重叠,差异率小于差异率小于6%.3)Unitigger(重叠单元重叠单元)建立建立:一组彼此重叠的一组彼此重叠的 DNA顺序顺序,其中不存在争议的或不确定的重其中不存在争议的或不确定的重 叠关系叠关系,为独立的重叠群为独立的重叠群.4)支架支架(scaffold)搭建搭建:由一组由一组Unitigger相互叠相互叠 合以及由合以及由BAC克隆末端顺序指认彼此相邻的克隆末端顺序指
16、认彼此相邻的重叠群重叠群,内部可能有间隙内部可能有间隙.1)方法方法:鸟枪法鸟枪法2)测序测序l载体载体 插入子插入子(kb)测序次数测序次数 可读长度可读长度(bp)覆盖面覆盖面 l-质粒质粒(高拷贝高拷贝)2.0 1 903 468 570 7.3 x 质粒质粒(低拷贝低拷贝)10.0 1 278 386 567 5.4 x BAC 130.0 19 738 500 0.07 x -注注:测序总长测序总长1.2 x 1010,组装后草图组装后草图为为116.2 Mb.3)果蝇基因组总长果蝇基因组总长180 Mb,草图顺序占其草图顺序占其2/3.其余顺序为异染色质区其余顺序为异染色质区,约约
17、60 Mb.因异染色质区重复顺序大多因异染色质区重复顺序大多,不能有效克隆或组装不能有效克隆或组装.4)果蝇基因组草图仍有果蝇基因组草图仍有1000个间隙个间隙.5)草图顺序包含草图顺序包含97.5%基因基因.优点优点:1)覆盖面大覆盖面大,有些作图法丢失的顺序在鸟枪法有些作图法丢失的顺序在鸟枪法 中可发现中可发现.2)水稻基因的平均长度约水稻基因的平均长度约5 kb,组装的顺序不会组装的顺序不会 对基因的预测产生重要影响对基因的预测产生重要影响.缺点缺点:1)留下了留下了13万个间隙万个间隙,支架的长度很有限支架的长度很有限,平均平均 约约10-15 kb.存在大量的嵌合顺序存在大量的嵌合顺
18、序.2)没进行大克隆没进行大克隆(50 kb,150 kb)的两端测序的两端测序,很很难建立大跨度支架难建立大跨度支架.不能确定组装顺序的方向不能确定组装顺序的方向和准确的排列位置和准确的排列位置,无法无法独立独立锚定到染色体上锚定到染色体上.人类基因组鸟枪法测序是一个神化人类基因组鸟枪法测序是一个神化?1)1)丢失了丢失了20%20%的基因组顺序的基因组顺序,含有含有116 000116 000个间隙个间隙,平均长平均长2.3 2.3 kb.kb.2)2)利用了大量公开发表的人类基因组顺序作为组装的支点利用了大量公开发表的人类基因组顺序作为组装的支点,这这是一些极其关键的顺序是一些极其关键的
19、顺序.3)3)耗费耗费:作图法的费用为作图法的费用为,10%,10%用于用于BACBAC作图与亚克隆作图与亚克隆,50-,50-60%60%用于亚克隆测序用于亚克隆测序,覆盖率为覆盖率为5-65-6个当量个当量,30-40%,30-40%用于完成用于完成精确顺序测序精确顺序测序.鸟枪法费用为鸟枪法费用为,利用了发表的利用了发表的BACBAC物理图物理图,节省了节省了10%10%的费用的费用.由于避免顺序丢失由于避免顺序丢失,随机克隆的覆盖面随机克隆的覆盖面达到达到1515个基因组当量个基因组当量.此外利用了公共数据库中此外利用了公共数据库中BACBAC的两端的两端顺序顺序,减少了这部分的测序量
20、减少了这部分的测序量.总的费用实际远超过作图法总的费用实际远超过作图法测序测序.4)4)鸟枪法并未在真正意义上加速人类基因组计划的进程鸟枪法并未在真正意义上加速人类基因组计划的进程,人人类基因组测序计划组织在过去类基因组测序计划组织在过去7-87-8年中积累的物理图数据被年中积累的物理图数据被鸟枪法大量利用是其成功的主要因素之一鸟枪法大量利用是其成功的主要因素之一.1)Bermuda standard,百慕大標準百慕大標準2)草图顺序草图顺序:draft sequence3)完成顺序完成顺序:finished sequenceWorld standards for sequence fidel
21、ity(known as the Bermuda Standards)were established at the meeting of HGP principal investigators in 1997.(http:/www.gene.ucl.ac.uk/hugo/bermuda2.htm).These standards stated that finished sequence should contain less than one error per 10,000 DNA bases(99.99%accuracy),and that the sequence should be
22、 contiguous(without gaps).Nature 429,365-368(27 May 2004)1)1)达到普通质量但尚未完成的基因组达到普通质量但尚未完成的基因组DNADNA顺序顺序,其精确度高于其精确度高于90%.90%.所处染色体位置已知所处染色体位置已知,一一 般长度约般长度约10kb.10kb.2)2)草图顺序可分为草图顺序可分为3 3个等级个等级:Phase 0Phase 0:测序测序覆盖顺序一次覆盖顺序一次的的DNADNA序列序列;Phase 1Phase 1:测序测序覆盖顺序覆盖顺序4-104-10次次的的BACBAC克隆克隆,BAC BAC及内部片段的及内部
23、片段的位置和排列方向位置和排列方向 未定未定.Phase 2Phase 2:测序测序覆盖顺序覆盖顺序4-104-10次次的的BACBAC克隆克隆,BAC BAC及内部片段的及内部片段的位置和排列方向位置和排列方向 已定已定.1)完成顺序系指已测序的完成顺序系指已测序的,每每10000 个碱个碱基中出现一个差错基中出现一个差错,且内部不存在间隙且内部不存在间隙 的的DNA顺序顺序.2)完成顺序也称为完成顺序也称为Phase 3期顺序期顺序.1)样品样品 2)方法方法 3)结果结果1)1)国际联合体的测序结果国际联合体的测序结果:总长总长:2 692 Mb:2 692 Mb 基因数基因数:26 3
24、83:26 3832)Cerela2)Cerela Genomics Genomics 的测序结果的测序结果:总长总长:2 847 Mb:2 847 Mb 基因数基因数:31 778:31 778染色体编号染色体编号 长度长度(Mb)染色体编号染色体编号 长度长度(Mb)-1 212.2 13 92.9 2 221.6 14 86.9 3 186.2 15 73.4 4 168.1 16 72.8 5 169.7 17 72.8 6 158.1 18 72.9 7 146.2 19 55.4 8 124.3 20 60.5 9 106.9 21 33.8 10 127.1 22 33.8 11
25、 128.6 X 127.7 12 124.5 Y 21.8 NA 5.1 UL 9.3-NA:未确定重叠群的克隆未确定重叠群的克隆;UL:未确定染色体位置的克隆未确定染色体位置的克隆 注注:数字取自国际人类基因组联合体数字取自国际人类基因组联合体(nature,409:873,2001)Celera Genomics采取采取WGA和和CSA策略组装的人类基因组结果比较策略组装的人类基因组结果比较-项目项目 WGA CSA-位于支架中的顺序（位于支架中的顺序（bp）2 847 890 390 2 905 568 203位于重叠群中的顺序位于重叠群中的顺序（bp）2 586 634 108 2
26、653 979 733支架数目支架数目 118 968 170 033重叠群数目重叠群数目 221 036 170 442间隙数目间隙数目 102 068 116 442 小于或等于小于或等于1kb间隙数目间隙数目 62 356 72 091支架平均长支架平均长(bp)23 938 54 217重叠群平均长重叠群平均长(bp)11 702 15 609支架间隙平均长支架间隙平均长(bp)2 560 2 161-注注:WGA,全基因组组装全基因组组装;CSA,局部区间组装局部区间组装.1)人类基因组草图在富含基因的常染色体上约有人类基因组草图在富含基因的常染色体上约有10%的遗漏的遗漏，整体而言
27、约有整体而言约有30%遗漏遗漏（包括（包括基因匮乏的异染色质区基因匮乏的异染色质区)，忽略或错序的总数，忽略或错序的总数约为数十万。约为数十万。2)人类基因组人类基因组草图有草图有341个遗漏个遗漏，涉及，涉及3800万个万个碱基对碱基对.3)“鸟枪法鸟枪法”无法测到人类基因组中无法测到人类基因组中重复出现的重复出现的DNA片段片段，这些片段占到基因组的，这些片段占到基因组的3至至5，对于理解遗传性疾病具有重要意义。对于理解遗传性疾病具有重要意义。lMay 27,2004人類基因組測序項目完成近半人類基因組測序項目完成近半隨著第隨著第9號和第號和第10號人類染色體準確測序和分析結果的發表，號人
28、類染色體準確測序和分析結果的發表，人類基因組測序項目已完成近半。迄今已發表的人類染色體人類基因組測序項目已完成近半。迄今已發表的人類染色體有第有第6、7、9、10、13、14、19、20、21、22號染色體和號染色體和Y染色體，剩下染色體，剩下12個已編號的染色體和個已編號的染色體和X染色體有待完成染色體有待完成.“人人類基因組項目類基因組項目”所收集的序列數據是按照所收集的序列數據是按照“百慕大標準百慕大標準”獲獲取的，將目標準確性定為取的，將目標準確性定為99.99%，即每，即每10000個個DNA鹼基中鹼基中不到不到1個錯誤。來自個錯誤。來自“斯坦福人類基因組中心斯坦福人類基因組中心”的
29、一個研究的一個研究小組對人類基因組序列數據做了一個質量評估，他們得出結小組對人類基因組序列數據做了一個質量評估，他們得出結論認為，在整個基因組中，論認為，在整個基因組中，“百慕大標準百慕大標準”被超過了被超過了10倍，倍，使得每使得每10000個個DNA鹼基中不到鹼基中不到1個錯誤。個錯誤。2006年年10月月4日美国日美国X奖基金会宣布设立一项金额高达奖基金会宣布设立一项金额高达1000万美元的奖金，激励科学家万美元的奖金，激励科学家“多快好省多快好省”地绘制地绘制出人类基因图谱。出人类基因图谱。X X奖基金会希望这笔钱能激励科学家奖基金会希望这笔钱能激励科学家在在1010天内绘制出天内绘制
30、出100100个人的基因图谱。个人的基因图谱。基金会还提供了一笔基金会还提供了一笔100100万美元的额外奖金，只要有人能万美元的额外奖金，只要有人能为为100100个名人、科学家和亿万富翁破译基因密码，就能个名人、科学家和亿万富翁破译基因密码，就能得到这笔奖金。这得到这笔奖金。这100100个人包括微软公司创始人之一保个人包括微软公司创始人之一保罗罗艾伦与搜索引擎谷歌（艾伦与搜索引擎谷歌（googlegoogle）的合作创始人之一）的合作创始人之一拉里拉里佩奇等佩奇等.这一举措表明社会希望人类基因组测序能进入个性化服务这一举措表明社会希望人类基因组测序能进入个性化服务时代时代.从目前的技术水
31、平来看从目前的技术水平来看,实现这一目标还有相当实现这一目标还有相当长的路要走长的路要走.Published online of Nature,:5 October 2006;|doi:10.1038/news061002-9 Genome sequencing X Prize announcedCompetition on to sequence 100 human genomes in 10 days:how tough can it be?Heidi LedfordTwo years to the day after the first private craft carrying a
32、person to the edge of space clinched the Ansari X Prize spaceflight competition,the X Prize Foundation has announced its next contest:sequencing 100 human genomes in 10 days.引自引自:Nature 420:523-562,2002.引自引自:Nature 420:523-562,2002.老鼠基因组老鼠基因组88个超个超大重叠群大重叠群.所有老鼠所有老鼠染色体均为近端着染色体均为近端着丝粒染色体丝粒染色体,着丝粒着丝粒位于
33、端部位于端部.利用利用MIT绘制的遗传图进行绘制的遗传图进行超大重叠群锚定超大重叠群锚定.根根据据BAC指纹图和辐指纹图和辐射杂种图验证重叠射杂种图验证重叠群相邻关系群相邻关系.88个超个超大重叠群覆盖了基大重叠群覆盖了基因组因组95%的常染色的常染色体区体区.1)玉米基因组大小为玉米基因组大小为2500 Mb(2.5 x 109),约约80%DNA顺序由逆转座子组成顺序由逆转座子组成.2)虽然利用虽然利用EST(expressed sequence tag)可从基可从基因组中抽提出基因组顺序因组中抽提出基因组顺序,但因表达丰度过低但因表达丰度过低或组织专一性表达的原因或组织专一性表达的原因,
34、ESTs库会丢失库会丢失50%的基因成员的基因成员.3)绝大多数逆转座子和非基因编码区都被甲基绝大多数逆转座子和非基因编码区都被甲基化化,而而95%的基因未甲基化的基因未甲基化.因此采用大肠杆因此采用大肠杆菌菌McriA和和McriB系统构建玉米基因组文库系统构建玉米基因组文库,可用以富集基因顺序可用以富集基因顺序.引自引自:Science 302:2115-217,20031)1)大肠杆菌大肠杆菌McriAMcriA和和McriBMcriB系统系统可以破坏入侵可以破坏入侵的含有胞嘧啶甲基化的外源的含有胞嘧啶甲基化的外源DNA,DNA,动物和植动物和植物物DNADNA对这一系统也很敏感对这一系
35、统也很敏感.2)2)用甲基化敏感的限制酶切割玉米基因组用甲基化敏感的限制酶切割玉米基因组DNA,DNA,将克隆载体转化大肠杆菌将克隆载体转化大肠杆菌McriAMcriA和和McriBMcriB系系统菌系统菌系,凡是含有胞嘧啶甲基化的克隆均被凡是含有胞嘧啶甲基化的克隆均被淘汰淘汰,使基因富集使基因富集7 7倍倍.3)3)采用甲基化过滤法可将玉米基因组中采用甲基化过滤法可将玉米基因组中93%93%的的甲基化顺序除去甲基化顺序除去.经过滤后有经过滤后有24%24%的顺序与的顺序与基因匹配基因匹配,而未过滤的仅而未过滤的仅1.4%1.4%与基因匹配与基因匹配.引自引自:Science 302:2115
36、-2117,2003.1 1）专利问题专利问题 提供缺陷型基因的人员在研究成果获得商提供缺陷型基因的人员在研究成果获得商 业利益时是否有权要求给予报酬或拥有部份专利；业利益时是否有权要求给予报酬或拥有部份专利；2 2）人类基因组顺序的）人类基因组顺序的公开利用公开利用问题问题 如何确定基因的好如何确定基因的好 坏，一旦某人所谓坏，一旦某人所谓“次等次等”的基因被人获知，是否的基因被人获知，是否会会 受到歧视与不公正待遇；受到歧视与不公正待遇；3 3）保险保险公司是否有权获知投保人的基因资料，是否有权公司是否有权获知投保人的基因资料，是否有权 要求投保人进行某些敏感基因的测试；要求投保人进行某些
37、敏感基因的测试；4 4）投保人的基因资料是否具有）投保人的基因资料是否具有隐私权隐私权，可否拒绝保险公，可否拒绝保险公 司，招聘单位，所在部门上级主管提出的获知基因资司，招聘单位，所在部门上级主管提出的获知基因资 料的要求料的要求；5 5）某些公司可能提出一些看似正当的理由，如工作环）某些公司可能提出一些看似正当的理由，如工作环 境不利于一些基因组顺序中存在某些境不利于一些基因组顺序中存在某些“缺陷缺陷”的人员的人员 而拒绝他们的工作申请，尽管这些人员确有专长。而拒绝他们的工作申请，尽管这些人员确有专长。6 6）已经确定婚姻关系的配偶双方或即将踏入婚姻之旅）已经确定婚姻关系的配偶双方或即将踏入
38、婚姻之旅 的恋人是否有权获知对方基因组中自己感兴趣的基的恋人是否有权获知对方基因组中自己感兴趣的基 因组成；因组成；7 7）什么是坏基因什么是坏基因:社会如何对待那些被认为具有社会如何对待那些被认为具有“暴力暴力”倾向基因型的成员；倾向基因型的成员；8 8）“敏感敏感”顺序的法律保护顺序的法律保护:雇员是否可以因为基因组雇员是否可以因为基因组 “敏感敏感”顺序而有权拒绝雇主或上级部门的工作调动顺序而有权拒绝雇主或上级部门的工作调动 与安排。与安排。随着基因组计划的深入，诸如此类的问题已经提上议事随着基因组计划的深入，诸如此类的问题已经提上议事日程，如何处理这些问题是对人类智慧的考验。日程，如何
39、处理这些问题是对人类智慧的考验。目前还没有关于目前还没有关于“基因歧视基因歧视”的诉讼对薄的诉讼对薄于美国联邦和地方法院，但是于美国联邦和地方法院，但是20012001年美年美国同等就业机会委员会（国同等就业机会委员会（Equal Equal Employment Opportunity Commission,Employment Opportunity Commission,EEOCEEOC）接手了一个著名的）接手了一个著名的“基因歧视基因歧视”案例案例BNSFBNSF铁路公司（铁路公司（Burlington Burlington Northern Santa Fe(BNSF)Railroa
40、d Northern Santa Fe(BNSF)Railroad）在员工体检时暗地检测了会导致在员工体检时暗地检测了会导致“腕关腕关节综合症（节综合症（carpal tunnel syndromecarpal tunnel syndrome）”的基因表达谱，该公司声称此基因检测的基因表达谱，该公司声称此基因检测是为了判断是为了判断“腕关节综合症腕关节综合症”在公司员在公司员工中的高发病率究竟是由于遗传因素还工中的高发病率究竟是由于遗传因素还是职业病。而一位拒绝做检测的员工则是职业病。而一位拒绝做检测的员工则被公司威胁要解除合同。被公司威胁要解除合同。EEOCEEOC判定判定BNSFBNSF铁
41、路公司违反了美国的残疾人法，因为铁路公司违反了美国的残疾人法，因为基因检测结果会造成对有基因缺陷的员基因检测结果会造成对有基因缺陷的员工的非法歧视。工的非法歧视。佛山基因歧佛山基因歧視視案案 20092009年年4 4月，三名考生月，三名考生參參加佛山市公加佛山市公務員務員考考試並順試並順利利通通過筆試過筆試和面和面試試，6 6月月參參加公加公務員體檢務員體檢，隨隨後被告後被告知平均知平均紅細紅細胞胞體積體積(MCV)(MCV)偏小，偏小，復檢復檢後得到了相同後得到了相同的的結結果。之後，三名考生致果。之後，三名考生致電電佛山人事局工作人佛山人事局工作人員員，被告知只要是地中海被告知只要是地中
42、海貧貧血，血，無論無論何何種種情情況況，體檢結體檢結論論都是不合格；他都是不合格；他們們因此失去了被因此失去了被錄錄用用為為公公務員務員的的機會機會。9 9月月1616日，三名考生向佛山市政府申日，三名考生向佛山市政府申請請行政行政復議復議。三。三個個月後，佛山市政府月後，佛山市政府維維持了佛山市人事局持了佛山市人事局有有關體檢關體檢不合格的不合格的決決定。定。1212月月2929日，三名考生前往日，三名考生前往禪禪城城區區法院法院遞遞交起交起訴狀訴狀，請請求法院求法院責責令佛山市人力令佛山市人力資資源和社源和社會會保障局保障局(原佛山市人事局，下原佛山市人事局，下稱稱佛山市佛山市人社局人社局
43、)認認定他定他們體檢們體檢合格，合格，並並按程序按程序對對其其進進行考行考察察錄錄用。用。佛山市中佛山市中級級人民法院（下人民法院（下稱稱佛中院）佛中院）20102010年年9 9月月4 4日作日作出出終審終審判判決決,三名考生三名考生敗訴敗訴。这是这是國內國內基因歧基因歧視視第一案第一案 1)1)链终止法测序的原理是什么链终止法测序的原理是什么?2)DNA2)DNA测序中采用的测序中采用的DNADNA多聚酶与细胞的多聚酶与细胞的DNADNA多聚酶多聚酶 有什么差别有什么差别?3)3)鸟枪法测序与作图法测序的差别鸟枪法测序与作图法测序的差别?4)4)为何原核生物基因组更适合鸟枪法测序为何原核生
44、物基因组更适合鸟枪法测序?5)5)图解说明图解说明BACBAC克隆测序与顺序组装的过程克隆测序与顺序组装的过程.6)6)为何为何BACBAC克隆测序和全基因组鸟枪法测序都会留克隆测序和全基因组鸟枪法测序都会留 下间隙下间隙?7)7)什么是物理间隙什么是物理间隙?什么是顺序间隙什么是顺序间隙?如何填补如何填补 这两类间隙这两类间隙?8)8)大型基因组鸟枪法测序的缺点是什么大型基因组鸟枪法测序的缺点是什么?9)9)基因组鸟枪法测序要构建大小不同的插入片段基因组鸟枪法测序要构建大小不同的插入片段 克隆文库克隆文库,原因何在原因何在?10)10)为何着丝粒区和近端粒区为何着丝粒区和近端粒区DNADNA的测序非常困难的测序非常困难?11)11)有哪些方法可用来判断有哪些方法可用来判断DNADNA顺序组装的正确与否顺序组装的正确与否?12)12)什么是甲基化过滤法测序什么是甲基化过滤法测序?为何玉米基因组测为何玉米基因组测 序采取甲基化过滤测序序采取甲基化过滤测序?
