1、第五章第五章分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNADNA、RNARNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术 现代分子生物学的快速发展，得益于上现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。和基因工程技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。
2、基因工程基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。繁殖和表达。基因工程技术基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生
3、物细胞之中的能力，是基因工程因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。技术区别于其它技术的根本特征。重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件（三大成就）：技术发展史上的重大事件（三大成就）：一、一、在在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携带者（即基因年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体是的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题）；础问题）；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模型和半保留分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替
4、问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、三、50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和操和操纵子学说纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。流动与表达机制。5.15.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具5.25.2 DNA DNA操作技术操作技术5.35.3 RNA RNA基本操作技术基本操作技术5.45.4 SNP SNP的理论与应用的理论与应用5.55.5 基因克隆（基因克隆（cloneclone）技术）技术5.65.6 蛋白质与蛋白质组学技术蛋白质与蛋白质组学技术（一）（一）限制性
5、核酸内切酶限制性核酸内切酶能够识别能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切上的特定碱基序列并从这个位点切开开DNA分子。分子。第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRI是是Boyer实验室在实验室在1972年发现的，年发现的，它能特异性识别它能特异性识别GAATTC序列，将双链序列，将双链DNA分子在这个位分子在这个位点切开并产生具有点切开并产生具有粘性末端粘性末端（不是整齐地切开，即在两条（不是整齐地切开，即在两条链上的切开位点不对称）的小片段。链上的切开位点不对称）的小片段。5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点内切
6、酶所识别的序列及其酶切位点（二）基因克隆的载体（二）基因克隆的载体基因克隆基因克隆即重组即重组DNA技术技术,指在体外对指在体外对DNA分子按照分子按照既定的目的和方案既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的采用酶学方法将不同来源的DNA分分子在体外剪切和重新连接子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的组装成一个新的DNA分子。分子。在此基础上在此基础上,将这个将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子形成大量的子代分子,此此过程即称为基因克隆过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节基因克隆包括四个
7、基本技术环节:目的基因和载体的获得;目的基因与载体连接,形成重组分子;重组DNA分子导入宿主细胞;含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增；基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。基因克隆载体的三要素：基因克隆载体的三要素：自我复制能力；自我复制能力；携带外源基因片段大小；携带外源基因片段大小；插入位点多少；插入位点多少；易于鉴定识别程度。易于鉴定识别程度。大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有胞仅有12个拷贝。个拷贝。长长9.09kb，带有
8、四环素抗性基因，带有四环素抗性基因（tetr）及）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以以及及SmaI等等7种限制性核酸内切酶种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在的单酶切位点，在HindIII、BamHI和和SalI等等3个位点插入外源个位点插入外源基因，会导致基因，会导致tetr失活。失活。大肠杆菌大肠杆菌pSC101质粒质粒载体示意图。载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。是第一个真核基因克隆载体。缺点：缺点：它是一种严紧型复制控制它是一种严紧型复制控制（在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有12个/
9、每染色体。）的的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取提取pSC101 DNA，产量很低。，产量很低。2、ColE1质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每却继续复制数小时，使每个寄主细胞中个寄主细胞中Co
10、lE1质粒的拷贝数达到质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总个，占细胞总DNA的的50%左右。左右。3、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。具有广泛的用途。5.
11、2.1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。5.2 DNA操作技术操作技术一种分子被放置到电场中，它就会以一一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫
12、电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的做电泳的迁移率，迁移率，它与电场强度和电泳它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，化状态，所以，DNA和和RNA又被称为多聚阴又被称为多聚阴离子离子（polyanions），在电场中），在电场中向正电极的向正电极的方向迁移。方向迁移。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因几乎具有等量的净电荷，因此它
13、们能此它们能以同样的速度向正电极方向迁移以同样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000
14、0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501溴化乙锭染料的化学结溴化乙锭染料的化学结构及其对构及其对DNADNA分子的插分子的插入作用。入作用。由于插入了溴由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电照射下，琼脂糖凝胶电泳中泳中DNADNA的条带便呈现的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴出橘黄色荧光，易于鉴定。（定。（溴化乙锭是高度溴化乙锭是高度灵敏的荧光染色剂，灵敏的荧光染色剂，具具有高致癌性有高致
15、癌性!普通浅黄普通浅黄色乳胶手套不能很好的色乳胶手套不能很好的阻挡，最好用蓝色实验阻挡，最好用蓝色实验用手套。）用手套。）DNA脉冲电场凝胶电泳（脉冲电场凝胶电泳（PFGE pulsed-field gel electrophoresis）示意图示意图 在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成45夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建
16、好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。细菌转化细菌转化（transformation），是指一种细菌），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性而导致性状特征发生遗传改变的过程。状特征发生遗传改变的过程。提供转化提供转化DNA的的菌株叫作菌株叫作供体菌株供体菌株，接受转化，接受
17、转化DNA的细菌菌株的细菌菌株则被称为则被称为受体菌株受体菌株。细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。）。蓝白斑筛选蓝白斑筛选原理图原理图两种增强转化的处理方法：两种增强转化的处理方法：CaCl2法法将快速生长期大肠杆菌置于经将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗预处理的低渗CaCl2溶液中，溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源细胞膨胀，膜通透性改变，易与
18、外源DNA相粘附。相粘附。将该体系转移到将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。性克隆。转化效率可达到转化效率可达到51062107个个转化子转化子/g超螺旋质粒超螺旋质粒DNA（转化后的受体菌称为转化子转化后的受体菌称为转化子transformant）。）。电击法电击法电脉冲电脉冲（电场强度、方向或电流的周期性变化）可（电场强度、方向或电流的周期性变化）可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞
19、。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的介质中的DNA易于进入细胞质。易于进入细胞质。电脉冲处理的具体方法：电脉冲处理的具体方法：将生长至对数中期的将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至菌液冷却至4后离心，洗菌后用后离心，洗菌后用10%的甘油的甘油悬浮，将高密度菌液（悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的）置于特制的电极杯中进行电击。电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为时间跨度一般为4.55.5毫秒毫秒。电击转化与温度有关，一般在电击转化与温度
20、有关，一般在04进行。由于进行。由于转化载体上常带有转化载体上常带有LacZ基因（基因（大肠杆菌乳糖操大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因）纵子中的一个基因），多用带有不同抗生素（常，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化等）的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。细胞。5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用序列最常用的方法。的方法。PCR反应的模板反应的模板DNA若是基因组上的某个片若是基因组上的某个
21、片段，就称为段，就称为genomic PCR，若是，若是mRNA反转反转录产生的录产生的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。PCR技术的原理：技术的原理：首先将双链首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链分离成两条单链DNA分子，分子，DNA聚合酶以单聚合酶以单链链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。步骤（三步）：步骤（三步）：DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链的延伸）合成（链的延伸）经不
22、断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数（两条引物结合位点之间的分子数（两条引物结合位点之间的DNA区段区段的拷贝数），理论上的最高值应是的拷贝数），理论上的最高值应是2n,实得实得1.8n（n：循环次数）。循环次数）。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 PCR指数扩增时循环次数指数扩增时循环次数与与DNA产物数量的比较产物数量的比较DNA解链（解链（PCR的第一步）：高温处理的第一步）：高温处理将含有待扩增将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高样品的反应混合物放置在高温（温（94）环境下加热）环境下加热1分钟，使双链
23、分钟，使双链DNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNA。94加热，淬火加热，淬火引物与模板引物与模板DNA相结合相结合（第二步）：退火（第二步）：退火降低反应温度（退火，约降低反应温度（退火，约50），约），约1分钟，分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合DNA合成（第三步）：合成（第三步）：将反应混合物的温度上升到将反应混合物的温度上升到72左右保左右保温温1-数分钟，在数分钟，在DNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，从引物的
24、从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按沿着模板分子按53方向延伸，合成新方向延伸，合成新生生DNA互补链。互补链。PCR扩增，扩增，72左右左右,按每按每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复常规常规PCR技术能扩增两引物之间的技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知区段之外的未知DNA序列，这就需序列，这就需要应用要应用反向反向PCR（reverse PCR）技术）技术。先用一种在靶先用一种在靶DNA区段上没有识别位点区段上没有识别位点的核酸限制内切酶，从距靶
25、的核酸限制内切酶，从距靶DNA区段有一定区段有一定距离的两侧位置切割距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些分子，然后将这些片段作片段作分子内连接分子内连接成环形。根据已知的靶成环形。根据已知的靶DNA序列按序列按向外延伸向外延伸的要求设计一对向外引的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的区段两侧的未知未知DNA序列。序列。反向反向PCR的基本操作的基本操作程序。程序。波纹线表示靶波纹线表示靶DNA区段，箭头表示区段，箭头表示限制性内切酶位点，限制性内切酶位点，分 别 用 方 框 表 示 靶分 别 用 方 框 表 示 靶DNA区段的左侧和右区段的左侧
26、和右侧序列。侧序列。用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化切酶消化DNA；产生大小不同的线性产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶片段群体，其中靶DNA区段的区段的DNA分子长度不超过分子长度不超过23kb，经连接后重新，经连接后重新环化；环化；按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；其延伸方向如箭头所指；经经PCR扩增产生的主要是线性双链扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它分子，它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其接点是是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其接点是所
27、用限制性内切酶的识别位点。所用限制性内切酶的识别位点。5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由于由于PCR敏感性高（敏感性高（在几个小时内将特异的一段在几个小时内将特异的一段DNA序列扩增到数百万倍以上序列扩增到数百万倍以上），扩增产物总量变），扩增产物总量变异系数大，定量不准确。异系数大，定量不准确。90年代末期出现了年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测利用荧光检测PCR仪绘制仪绘制DNA扩增过程中的累积速扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题
28、。异系数较大的问题。混合在混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片反应液中的荧光探针只有与大片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成随着新合成DNA片段的增加，由于结合到片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。相应增加。非序列特异性荧光染料非序列特异性荧光染料SYBR Green I,激发激发光波长光波长520nm。SYBR Green I作探针的实时作探针的实时定量定量PCR实验实验过 程 示 意 图过 程 示 意 图（荧光强度反（荧光强度反映映PCR产物的产物的量）量）Han P.,Li
29、 Q.,and Zhu Y.X.(2008)The Plant Cell 20:1482-1493.（野生型拟南芥）（野生型拟南芥）（野生型拟南芥的突变体）（野生型拟南芥的突变体）P169为确保荧光检测的确实是靶为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了，又设计了仅能仅能与目的与目的DNA特异结合的荧光探针特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶探针是一段与靶DNA序列中间部位序列中间部位结合的单链结合的单链DNA，长，长50bp-150bp，该，该DNA的的5和和3端带有短波长和长波长两个不同荧端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能光基团，由于彼此距离靠近，
30、在荧光共振能量转移（量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。而检测不到荧光。随着随着PCR反应的进行，反应的进行，TaqMan 探针结合到探针结合到目的目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性序列上，并且会被具有外切酶活性的的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。TaqMan探探针实时定量针实时定量PCR技术技术 Taq
31、Man探针具有三个要素。（见P168）在此状态下两个荧光基团十分接近，不发荧光。Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝法分析未知样品靶基因的绝对表达量。（对表达量。（P169）5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把某种生物的基因组把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。别与载体组合，导入微生物细胞，形
32、成克隆。汇集包含基因组中所有汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。文库。Clark和和Carbon于于1975年提出公式：年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：式中：N表示一个基因组文库所应该包含的表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组段的长度与基因组DNA总长的比值。总长
33、的比值。为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的序列，基因组文库中的DNA片段常大于片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为以人为例，其基因组大小为3109bp若若p=99%，平均插入片段大小为，平均插入片段大小为20kb，则，则N=6.9105。构建基因组文库最常用的是构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克噬菌体载体（克隆能力约隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内个核苷酸的核酸限制性内切酶切酶Sau3A，与，与BamHI是一对同尾酶消化是一对同尾酶消
34、化DNA，由，由Sau3A酶切产生的酶切产生的DNA片段可插入片段可插入到经到经BamHI消化的消化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。用用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因限制性核酸内切酶消化真核生物基因组组DNA并利用并利用 噬菌体载体构建基因组文库的噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。过程图示。噬菌体作为克隆噬菌体作为克隆载体载体此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）、）、P1源人工染色体源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（）、酵母人工染色体（YAC）等都可用）等都可用于基因组文库的构建。于基因组
35、文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。缺失现象。操作也相对较困难。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术真核生物基因组真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的来自反转录的mRNA，无冗余序列，无冗余序列，通过筛选通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关文库，可较快地分离到相关基因。基因。细胞中的总细胞中的总RNA包括包括mRNA，rR
36、NA，tRNA以以及一些小及一些小RNA（sRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：，其中：80%-85%为为rRNA15%-20%为为tRNA及及sRNAmRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是别是28S和和18S特征性条带是电泳鉴定总特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。Li Q et al.(2006)J.Integr.Plant Biol.48:114-120.图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化
37、过程简图。化过程简图。RNA的浓度和纯度可以通过测定其的浓度和纯度可以通过测定其OD260和和OD2 8 0 来判断。来判断。OD2 6 0为为1时相当于浓度为时相当于浓度为40g/ml，而，而OD260/OD280的比值如果在的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值的比值将明显低于将明显低于1.8。由于由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，所包含的功能基因信息，一般
38、将其反转录成稳定的一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我），再插入到可以自我复制的载体中。复制的载体中。图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止菌株以防止cDNA被降解。被降解。cDNA文库的构建文库的构建cDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载之间，质粒
39、载体和噬菌体类载体都能满足要求。体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用文库常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。基因文库的筛选
40、基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。1、核酸杂交法：、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂探针适用于高密度的菌落杂交筛选。交筛选。将待筛选菌落转
41、移到硝酸纤维素膜上，适将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶随之变性。用蛋白酶K处处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。的印迹。80烘烤滤膜，将烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜固定在膜上。将滤膜与放射性标记的与放射性标记的DNA或或RNA探针杂交，通探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找
42、到相应克隆。平板上的位置找到相应克隆。图图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图2、PCR筛选法筛选法将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在可）保存在多孔培养板上多孔培养板上，用设计好的目的基，用设计好的目的基因探针对每个孔进行因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。出与目的基因对应的单个克隆
43、为止。3、免疫筛选法、免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。图图5-18 噬菌体噬菌体表达文库的免表达文库的免疫化学筛选法疫化学筛选法示意图示意图 5.4 SNP的理论与应用的理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism的的缩写，即缩写，即单核苷酸多态性单核苷酸多态性，指基因组，指基因组DNA序序列中由于单个核苷酸（列中由于单个核苷酸（A，T，C和和G）的突变）
44、的突变而引起的多态性。而引起的多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换由单个碱基的转换(transition)或颠换或颠换(transversion)所引起，所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括并不包括后两种情况。后两种情况。5.4.1 SNP概述概述科学上把染色体科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性
45、。最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（度多态性（RFLP）和微卫星标记（）和微卫星标记（SSR）之）之后的第三代遗传标记。后的第三代遗传标记。染色体上共同遗传的染色体上共同遗传的SNPSNP组合组合图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点有等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。因。因此，染色体对有两种可能的此，染色体对有两种可能的SNP组合。组合。单倍单倍型型基因基因型型外显子外显子IV内含子内含子IV57130165
46、232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较不同单倍型和基因型之间的多态性比较据估计，人类据估计，人类DNA中每中每300-1000个碱基对就个碱基对就有一个有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带，因此，一个人类个体大约携带300万万-1000万个万个SNPs。位于染色体上某一区。位于染色体上某一区域的一组相关联的域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍等位位点被称作单倍型（型（haplotype），相邻），相邻SNPs的
47、等位位点倾的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。向于以一个整体遗传给后代。根据根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区SNP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSN
48、P），碱基序列的改变使），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。5.4.2 SNP的检测技术的检测技术通过通过DNA测序法获得新的测序法获得新的SNP。基因分型（基因分型（genotyping）是指利用数据库中）是指利用数据库中已有的已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率进行特定人群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术、的研究，主要包括基因芯片技术、Taqman技技术、分子信标（术、分子信标（molecular beacons）技术）技术和焦磷酸测序法（和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。1基因芯片技术
49、基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。列杂交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样样品的复杂性，有些品的复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。2Taqman技术技术PCR反应系统中加入反应系统中加入2种不同荧光标记的分别种不同荧光标记的分别与两个等位基因配对的探针。随
50、着与两个等位基因配对的探针。随着PCR的进行，的进行，与模板完全配对的探针逐步被与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶聚合酶的的53外切活性所切割，荧光基团与外切活性所切割，荧光基团与3端的端的淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，供体荧光基团依然被淬灭。割，供体荧光基团依然被淬灭。3分子信标（分子信标（molecular beacon）技术）技术是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由环状区
