1、初级分离初级分离第五章第五章n初级分离初级分离：是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内提取液（细胞破碎液）及其他各种生物原料中，初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。n初级分离的对象具有体积大、杂质含量高等体积大、杂质含量高等特点，因此初级分离技术应具有操作成本低、适合大规模生产操作成本低、适合大规模生产的优势。n初级分离方法初级分离方法：固液分离（离心、过滤）、膜分离、萃取、固液分离（离心、过滤）、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级和泡沫分离等。吸附、沉淀分级和泡沫分离等。第一节第一节 杂质种类杂质种类a.a.高价无机离子（高价无机离子（CaCa2+2+、MgMg2+2+、Fe
2、Fe2+2+）b.b.杂蛋白杂蛋白在采用离子交换纯化时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换纯化时，会影响树脂对生化物质的交换容量。u在采用离子交换和吸附法提取时，会降低其交换容量和吸附能力在采用离子交换和吸附法提取时，会降低其交换容量和吸附能力u在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。u在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。c.c.多糖多糖d.d.色素色素（一）高价无机离子的去除方法（一）高价无机离子的去除方法1.1.
3、CaCa2+2+草酸、草酸钠，草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸）；2.2.MgMg2+2+三聚磷酸钠，三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；溶性络合物；3.3.FeFe2+2+黄血盐，黄血盐，普鲁士兰沉淀普鲁士兰沉淀（二）杂蛋白的去除方法（二）杂蛋白的去除方法等电点沉淀等电点沉淀：蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。l在酸性溶液中带正电荷；在酸性溶液中带正电荷；l在碱性溶液中带负电荷。在碱性溶液中带负电荷。在某一在某一pHpH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷为零，溶解度最小，称为
4、等电点。1.1.沉淀法：等电点沉淀、酸碱沉淀沉淀法：等电点沉淀、酸碱沉淀l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和和Pb2+等形成沉淀。等形成沉淀。酸碱沉淀：使蛋白质与盐或离子形成沉淀。酸碱沉淀：使蛋白质与盐或离子形成沉淀。2.2.变性法变性法 加热；加热；大幅度调节大幅度调节pHpH值；值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表
5、面活性剂等。加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处不足之处a.a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物；b.b.极端极端pHpH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；量酸碱；c.c.有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。场合。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两在枯草杆
6、菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。粒子吸附并包裹在其中除去。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。以作为提取目标产物的技术手段。3.3.吸附法吸附法 酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。例如：万古霉素用淀粉作培养基，发酵完成后，发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大，当加入0.025的淀粉酶后，搅拌30min，再加2.5助滤剂（硅藻土），可使
7、过滤速率提高5倍。（三）多糖的去除（三）多糖的去除 发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。（四）有色物质的去除（四）有色物质的去除第二节第二节 沉淀分级沉淀分级n沉淀（沉淀（pr
8、ecipitationprecipitation）是指由于物理环境的变化，）是指由于物理环境的变化，使溶液中的溶质由液相变成使溶液中的溶质由液相变成固相析出固相析出的过程。的过程。n采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩浓缩的的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。处理。n沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即沉淀方法用于分离
9、纯化是有选择性的，即有选择地有选择地沉淀杂质沉淀杂质或或有有选择地选择地沉淀所需成分沉淀所需成分。n生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。稳定性。n沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。分开的技术。n沉淀和结晶的区别沉淀和结晶
10、的区别:形态形态：不定形：不定形 成分纯度成分纯度：纯度较低：纯度较低n操作方式可分连续法或间歇法两种，规操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。模较小时，常采用间歇法。n沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤：加入沉淀剂。加入沉淀剂。沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。n加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。收率和沉淀物的形状都有很大影响。n沉淀技术分离生化产物的典型例子是沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白蛋白质质的分离提取。的分离提取。优点：设
11、备简单、成本低、原材料易得、优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；便于小批量生产；缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。纯度常比结晶法低，过滤也较困难。eg.从血浆中通过从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达步沉淀生产纯度高达99%的免的免疫球蛋白和疫球蛋白和96%99%的白蛋白。的白蛋白。图图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图n沉淀法分离蛋白质的特点沉淀法分离蛋白质的特点
12、：生产前期可使原料液体生产前期可使原料液体体积很快减小体积很快减小1050倍，倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个使中间产物保持在一个中性温和中性温和的环境；的环境；可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，分离出来，避免蛋白质的降解避免蛋白质的降解，提高产物稳定，提高产物稳定性；性；用蛋白质沉淀法作为用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理色谱分离的前处理技术，技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为是一个独
13、特的性质，由其蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象组成、构象以及分子周围的以及分子周围的环境环境所决定。所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的内部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。的大分子蛋白质更易溶解。图图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质性质蛋白质性质极性极性/非极性残非极性残基分布基分布溶剂可利用度溶剂可利用度（如：水）（如：水）分子大小分子大小
14、氨基酸残基的氨基酸残基的化学性质化学性质 pH值值氨基酸组成氨基酸组成蛋白质结构蛋白质结构离子强度离子强度氨基酸序列氨基酸序列蛋白质电性蛋白质电性温度温度可离子化的残基数可离子化的残基数化学键性质化学键性质极性极性/非极性残基比率非极性残基比率 溶液性质溶液性质表表1 影响蛋白质溶解度的参数影响蛋白质溶解度的参数蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质周围的蛋白质周围的水化层水化层（hydration shell)hydration shell)可以使可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间蛋白质分子间静电排斥静电排斥作用。（存在双电层）作用。（存在双电
15、层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。现蛋白质的沉淀。n蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的羧基的离子化形离子化形成的，换句话说，该球体成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。和絮凝现象相似。n蛋白质粒
16、子在水溶液中是带电的蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。溶液中反离子的电荷构成双电层。图图3吸引力n颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用n颗粒间的相互作用的位能取决于颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度离子强度。n Van der Waals Van der Waals 力力nKeeson Keeson 引力（偶极力）引力（偶极力）nDebye D
17、ebye 引力引力 （诱导力）（诱导力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一种引力，（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。遍存在的。oDLVO理论 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。总位能
18、表现为吸引位能。虽然这个理论所假定虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。的沉淀剂及技术。其他沉淀法其他沉淀法金属沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法蛋白质沉淀方法蛋白质沉淀方法有机溶剂盐析法有机溶剂盐析法等电点沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法中性盐盐析法一、中性盐盐析法一、中性盐盐析法n当中性盐加入蛋白质分散体系时可
19、能出现以下两当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：种情况：（1 1）“盐溶盐溶”现象现象(salting-in)(salting-in)低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。（2 2）“盐析盐析”现象现象(salting-out)(salting-out)高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降。高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降。中性盐盐析法：中性盐盐析法：破坏水化层、中和表面电荷破坏水化层、中和表面电荷图图4 中性盐盐析法机理示意图中性盐盐析法机理示意图离子强度对盐析过程的影响离子强度对盐析过程的影响nCohn经验公式经验公式nS蛋白质溶解度，蛋白质溶解度，mol/
20、L;nI离子强度离子强度 c:离子浓度；离子浓度；Z：离子化合价：离子化合价IKSslog221iiZcI，Ks常数常数和和KsKs的物理意义的物理意义n盐浓度为盐浓度为0 0时，蛋白质溶解度的对数值。时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、与蛋白质种类、温度、pHpH值有关，与盐无关；值有关，与盐无关；nKsKs盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、关，与温度、pHpH值无关。值无关。n 常数常数KsKs代表图中直线的斜率；代表图中直线的斜率；代表截距，代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想即当离子强度为零，也就是纯水中的假想n溶解度的
21、对数。从一些实验结果表明，溶解度的对数。从一些实验结果表明，KsKs与温度与温度和和pHpH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。无关，但和蛋白质与盐的种类有关。n但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，时，KsKs值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1 1倍。倍。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。易沉淀。影响盐析的因素影响盐析的因素n溶质溶质种类种类的影响：的影响：Ks和和值值n溶质溶质
22、浓度浓度的影响：的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；npH值值：影响蛋白质表面净电荷的数量：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系通常调整体系pH值，使其在值，使其在pI附近；附近；n盐析盐析温度温度：一般在一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法在一定的在一定的 pHpH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）
23、达到沉淀的目的，称为度）达到沉淀的目的，称为“s”s”分级盐析法。分级盐析法。（KsKs盐析盐析：固定：固定pH,pH,温度，温度，改变盐浓度改变盐浓度）在一定的离子强度下，改变溶液的在一定的离子强度下，改变溶液的pHpH值及温度，达到沉淀值及温度，达到沉淀的目的，称为的目的，称为“”分级盐析法。分级盐析法。（盐析：盐析：固定离子强度，固定离子强度，改变改变pHpH及温度及温度。）。）其中，其中，K Ks s盐析法（盐析法（改变盐浓度改变盐浓度）由于）由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处
24、理前处理。而而盐析法（盐析法（改变改变pHpH及温度及温度）由于溶）由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于此分辨率更高，常用于初步的纯化初步的纯化。盐析用盐的选择盐析用盐的选择n在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱子作用较弱 磷酸钾磷酸钾硫酸钠硫酸钠硫酸铵硫酸铵柠檬酸钠柠檬酸钠硫酸镁硫酸镁选用盐析用盐的几点考虑选用盐析用盐的几点考虑
25、n盐析作用要强盐析作用要强n盐析用盐需有较大的溶解度，能配制高浓度盐析用盐需有较大的溶解度，能配制高浓度n盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的n来源丰富、经济来源丰富、经济 常用于蛋白质沉淀的盐为常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵、硫酸钠和硫酸铵、硫酸钠和氯化钠氯化钠。硫酸铵硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，偏在水中的溶解度很高但具腐蚀性，偏酸性，溶解后溶液酸性，溶解后溶液pHpH下降，高下降，高pHpH会释放氨。后处会释放氨。后处理困难，残留在食品中影响风味，在临床医疗上理困难，残留在食品中影响风味，在临床医疗上有毒性，必须完全去除。有毒性，必须完全去除。硫酸钠硫酸钠虽无腐蚀性但低于虽无腐蚀
26、性但低于40400 0C C就不易溶解，因就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。氯化钠氯化钠需要高浓度，需要高浓度，1.5-2M1.5-2M。Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称力进行排序，称Hofmeister序列，或感序列，或感胶离子序。胶离子序。阴离子阴离子：柠檬酸根：柠檬酸根-3酒石酸根酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-；阳离子阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K
27、+Na+Li+。图图5 碳血红蛋白在不同盐溶液中的盐溶和盐析碳血红蛋白在不同盐溶液中的盐溶和盐析 左图表示对左图表示对卵清蛋白和碳氧血红卵清蛋白和碳氧血红蛋白蛋白进行盐析时，进行盐析时，随随pHpH的变化。的变化。由于由于代表溶解度的对数，故代表溶解度的对数，故 变化一个单位，溶解度就变化变化一个单位，溶解度就变化 1010倍。通常倍。通常在等电点附近有极小值。在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随两种蛋白质的相对溶解度会随pHpH而而变化很大；例如从图上可见，变化很大；例如从图上可见，当当 pHpH从从5 5变到变到6 6时，在一定盐浓度下，时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比
28、的变化可达两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍几千倍。pH的影响的影响n盐析后得到的产物，一般需要脱盐（透析、脱盐（透析、凝胶过滤等）凝胶过滤等）处理，才能进行后续的分离操作。二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同质离子具有不同等电点等电点这一特性，依次改这一特性，依次改变溶液变溶液pHpH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。最后获得目标产物。n机理：机理：较低离子强度的溶液中，蛋白质溶较低离子强度的溶液中，蛋白质溶解度较低；在等电点处，蛋白质所带静电解度较低；在等电点处，蛋白质所带
29、静电荷为零，蛋白质间静电排斥力最小，溶解荷为零，蛋白质间静电排斥力最小，溶解度最低。度最低。（1）适用于）适用于疏水性强疏水性强的蛋白质。而亲水性的蛋白质溶解度高，的蛋白质。而亲水性的蛋白质溶解度高，在等电点处不容易沉淀出来。在等电点处不容易沉淀出来。（2）采用）采用低离子强度低离子强度。中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方。中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。向移动，同时最低溶解度会有所增大。（3）蛋白的等电点通常在酸性范围内，所以主要是加入）蛋白的等电点通常在酸性范围内，所以主要是加入无无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）进行调节，机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）进行调节，价格
30、便宜，无毒价格便宜，无毒（4）pH不能过低，因为蛋白质对低不能过低，因为蛋白质对低pH 敏感，易失活敏感，易失活（5）与盐析法相比，不需要进行后续的脱盐操作。）与盐析法相比，不需要进行后续的脱盐操作。许多能与水互溶许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，丙酮、甲醇和乙腈，常用于常用于低低盐浓度下盐浓度下沉淀蛋白质沉淀蛋白质。三、有机溶剂沉淀法三、有机溶剂沉淀法图图7 pH4.8时人白蛋白在乙醇时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度水溶液中的溶解度1加入溶剂后会使水溶液的加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低介电常数降低，而使，而使蛋白质分子间的蛋白质分子间的静电引力增大静电
31、引力增大，导致凝集和沉，导致凝集和沉淀。淀。2蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被水被溶剂所取代溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。，从而降低了它们的溶解度。3有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的原来包在内部的疏水基团暴露疏水基团暴露于表面，并与有于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。白质沉淀。机理分析进展机理分析进展 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方
32、面不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。的影响，需通过试验加以选择。大致上以大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。蛋白质分子量越高，越容易沉淀出来，所蛋白质分子量越高，越容易沉淀出来，所需有机溶剂也越少。需有机溶剂也越少。在低离子强度和等电点附近，容易沉淀。在低离子强度和等电点附近，容易沉淀。有机溶剂沉析的特点有机溶剂沉析的特点n分辨率高；分辨率高；n溶剂容易分离，并可回收使用；溶剂容易分离，并可回收使用；n产品洁净，不需要脱盐处理；产品洁净，不需要脱盐处理；n容易使蛋白质等生物大分子失活容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在应注意在低温下
33、低温下操作；操作；n成本高成本高运用有机溶剂沉淀蛋白质应注意的因素：运用有机溶剂沉淀蛋白质应注意的因素：温度：低温温度：低温 乙醇浓度；乙醇浓度；pH值：等电点值：等电点 蛋白质浓度。蛋白质浓度。20世纪世纪60年代非离子型聚合物开始用年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的 方 法 被 广 泛 使 用，如：的 方 法 被 广 泛 使 用，如：聚 乙 二 醇聚 乙 二 醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡）、葡聚糖等。聚糖等。四、非离子型聚
34、合物沉淀法四、非离子型聚合物沉淀法图图8 蛋白质浓度对用蛋白质浓度对用PEG6000沉淀酵母醇脱氢酶时的影响沉淀酵母醇脱氢酶时的影响 基于基于体积不相容性体积不相容性，即，即PEG分子从溶分子从溶剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所用度取决于所用PEG的分子大小和浓度，排的分子大小和浓度，排斥体积与斥体积与PEG分子大小的平方根有关。分子大小的平方根有关。PEG沉淀作用的机理沉淀作用的机理 体系的温度只需控制在室温条件下；体系的温度只需控制在室温条件下；沉淀的沉淀的颗粒较大颗粒较大，产物易收集产物易收集；PEG非非但不会使大多数蛋白质变性，且但不会
35、使大多数蛋白质变性，且可提高可提高其稳定性。其稳定性。优点优点缺点缺点PEG难从蛋白质溶液中除去。难从蛋白质溶液中除去。聚电解质聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。等。机理：机理：蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，类似于形成一个多分子络合物，类似于絮凝絮凝，起架桥作，起架桥作用，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，用，当络合物
36、超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。另外，还有就发生沉淀。另外，还有盐析和降低水化程度盐析和降低水化程度的的作用。作用。五、聚电解质沉淀法五、聚电解质沉淀法1.能与能与羧基羧基、胺基胺基等含氮化合物以及等含氮化合物以及含氮杂含氮杂环化合物环化合物强烈结合的金属离子，如：强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；六、金属沉淀法六、金属沉淀法沉淀机理沉淀机理：金属离子与蛋白质分子中的特金属离子与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。殊部位起反应造成的。金属离子沉淀蛋白质可分为三类：金属离子沉淀蛋白质可分为三类：2.能与能与羧酸羧酸结合而不与
37、含氮化合物结合的结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；3.与与巯基巯基化合物强烈结合的金属离子，如：化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。实际使用时，金属离子的浓度常为实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。ZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶 近来，对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，开近来，对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，开始使用始使用金属的螯合物金属的螯合物来进行沉淀，如：用锌的螯合物与来进行沉淀，如：用锌的螯合物与基因工程的聚组胺酸肽段相结合，从而使蛋白质沉淀。基因工程的聚组胺酸肽段相结合，
38、从而使蛋白质沉淀。优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀出来。优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀出来。金属离子可以通过离子交换或者螯合剂除去。金属离子可以通过离子交换或者螯合剂除去。其它沉淀方法其它沉淀方法1.亲和沉淀亲和沉淀 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子的分子(免疫配位体、基质、辅酶等免疫配位体、基质、辅酶等)之间之间高度专一高度专一性的相互作用性的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。该方法提供了一个从复杂混合物中分离离技术。该方法提供了一个从复杂混合物中分离提取出单一产品的有效方法。提取出单一产品的有效方
39、法。其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。度的大小。初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤洗涤，洗去可能存在的杂质；，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中中离解离解出来。出来。该技术的三个步骤：该技术的三个步骤：蛋白质蛋白质配体配体载体载体胰蛋白酶胰
40、蛋白酶对对-氨基苯脒氨基苯脒苯甲基聚丙烯酰胺苯甲基聚丙烯酰胺小麦胚芽凝集素小麦胚芽凝集素 N-乙酰半乳糖乙酰半乳糖胺亚单位胺亚单位壳聚糖壳聚糖乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶汽巴克弄蓝汽巴克弄蓝葡聚糖葡聚糖表表2 亲和沉淀纯化蛋白质的实例亲和沉淀纯化蛋白质的实例2.选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法n选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等等杂质变性沉淀杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为种分离方法就称为选择性变性沉淀法。选择性变性沉淀法。（1）例如对于）例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热
41、处理，使大多数杂蛋可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。白受热变性沉淀而被除去。（2）根据欲分离物质所含杂质的特性，通）根据欲分离物质所含杂质的特性，通过改变过改变pH值或加进某些金属离子等使杂值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而被除去。蛋白变性沉淀而被除去。3.选择性溶剂沉淀法选择性溶剂沉淀法n核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方法又称为种方法又称为选择性溶剂沉淀法选择性溶剂沉淀法。n（1）在核酸提取液中加入氯仿）在核酸提取液中加入氯仿-戊
42、醇或氯仿戊醇或氯仿-辛醇，振荡辛醇，振荡一段时间、使一段时间、使蛋白质在氯仿蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除水的界面上形成沉淀而被除去，去，核酸仍然留在水溶液中。核酸仍然留在水溶液中。n（2）在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在的条件下，）在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在的条件下，用苯酚用苯酚-水溶液提取核酸，水溶液提取核酸，DNA、RNA存在于水溶液中，存在于水溶液中，而而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；n（3）在）在DNA、RNA混合溶液中，用混合溶液中，用异丙醇选择性地沉异丙醇选择性地沉淀淀DNA，而，而RNA留在溶液中。留在溶液中。选择沉淀方法的依据
43、选择沉淀方法的依据选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑：选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑：沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏；沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏；沉淀剂本身的性质；沉淀剂本身的性质；沉淀操作的成本、难易程度；沉淀操作的成本、难易程度；残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度的要求等。的要求等。沉淀法应用沉淀法应用n利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺白的工艺n柠檬酸的生产柠檬酸的生产n萃取萃取-沉淀法提取分离茶多酚沉淀法提取分离茶多酚标准沉淀法回收柠檬酸流程标准沉淀法回收柠檬酸流程图图加
44、热到加热到7070度度新工艺的主要种类新工艺的主要种类 n我国从上世纪我国从上世纪6060年代就开始研究非钙盐法的提年代就开始研究非钙盐法的提取工艺，近三、五年取得了实质性突破。根据取工艺，近三、五年取得了实质性突破。根据行业科技交流刊物的报道，已进行过中试或生行业科技交流刊物的报道，已进行过中试或生产规模试验的技术有三类：产规模试验的技术有三类：（1 1）是中国科学院和阜阳柠檬酸厂合作的是中国科学院和阜阳柠檬酸厂合作的“工工业业离子色谱法离子色谱法（ILCSILCS）法）法”（离色法）；（离色法）；（2 2）另一种是江南大学的另一种是江南大学的“连续变温逆流色谱连续变温逆流色谱分离法分离法”
45、（色谱法）；（色谱法）；（3 3）还有天津科技大学的还有天津科技大学的“吸附交换分离法吸附交换分离法”（吸交法）。（吸交法）。沉淀法生产茶多酚的一般工艺路线沉淀法生产茶多酚的一般工艺路线萃取法生产茶多酚的一般工艺路线萃取法生产茶多酚的一般工艺路线萃取萃取-沉淀法提取茶多酚工艺图沉淀法提取茶多酚工艺图n采用萃取采用萃取-沉淀法由茶叶中分离提取茶多酚的沉淀法由茶叶中分离提取茶多酚的收率较之于单纯的萃取法或沉淀法都要好收率较之于单纯的萃取法或沉淀法都要好。n提取处理时比较适宜条件为：提取处理时比较适宜条件为：8080乙醇作为浸提溶剂，萃取回流时间在乙醇作为浸提溶剂，萃取回流时间在2h2h左左右，萃取
46、介质的右，萃取介质的pHpH值在值在3 34 4，以，以ZnCl2ZnCl2作为沉淀作为沉淀剂处理浓缩液，剂处理浓缩液，6mol/L HCl6mol/L HCl对沉淀进行转溶处对沉淀进行转溶处理。最后得到的茶多酚粗品中含量约在理。最后得到的茶多酚粗品中含量约在7070，呈棕色结晶性粉末；精茶多酚中茶多酚含量在呈棕色结晶性粉末；精茶多酚中茶多酚含量在8585 以上，呈浅黄色结晶。以上，呈浅黄色结晶。n泡沫分离（foam separation）：是根据表面吸附的原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体气泡为载体，对液相中的溶质或颗粒进行分离。第三节第三节 泡沫分离法泡沫分离法19151915年用
47、于矿物浮选；年用于矿物浮选；5050年代用于分离金属离子的研究；年代用于分离金属离子的研究；6060年代采用泡沫分离法脱除洗涤剂工年代采用泡沫分离法脱除洗涤剂工厂污水中的表面活性剂获得成功；厂污水中的表面活性剂获得成功；19771977年报道泡沫分离法用于年报道泡沫分离法用于DNADNA、蛋白、蛋白质及液体卵磷脂等生物活性物质的分质及液体卵磷脂等生物活性物质的分离。离。泡沫分离是以泡沫分离是以气泡为介质气泡为介质，利用组分的，利用组分的表面表面活性差活性差进行分离的一种分离方法进行分离的一种分离方法p泡沫分离：按分离对象是溶液还是含有泡沫分离：按分离对象是溶液还是含有固体离子的悬浮液、胶体溶液
48、，泡沫分固体离子的悬浮液、胶体溶液，泡沫分离可分成：离可分成：泡沫分馏泡沫分馏（Foam FractionationFoam Fractionation）泡沫浮选泡沫浮选（Foam FlotationFoam Flotation）n泡沫分馏泡沫分馏用于分离用于分离溶解物质溶解物质，它们可以是，它们可以是表面活性剂，或者可与表面活性剂结合的表面活性剂，或者可与表面活性剂结合的物质，当料液鼓泡时能进入液层上方的泡物质，当料液鼓泡时能进入液层上方的泡沫层而与液相主体分离。沫层而与液相主体分离。n泡沫浮选泡沫浮选用于分离用于分离不溶解的物质不溶解的物质，按照被，按照被分离对象是分子还是胶体，是大颗粒还
49、是分离对象是分子还是胶体，是大颗粒还是小颗粒等，又可分为矿物浮选、粗粒浮选、小颗粒等，又可分为矿物浮选、粗粒浮选、微粒浮选、粒子浮选、分子浮选、沉淀浮微粒浮选、粒子浮选、分子浮选、沉淀浮选和吸附胶体浮选。选和吸附胶体浮选。p无泡沫分离：无泡沫分离：是指用鼓泡进行分离，但不是指用鼓泡进行分离，但不一定形成泡沫层，可分为一定形成泡沫层，可分为鼓泡分馏鼓泡分馏和和溶媒溶媒浮选浮选。鼓泡分馏鼓泡分馏是从它设备底部通气鼓泡，表面是从它设备底部通气鼓泡，表面活性物质被气泡富集并上升至塔顶，和液活性物质被气泡富集并上升至塔顶，和液相主体分离，使得溶质得到浓缩，液相主相主体分离，使得溶质得到浓缩，液相主体被净
50、化。体被净化。溶媒浮选溶媒浮选是在溶液顶部设置有一种与其互是在溶液顶部设置有一种与其互不相溶的溶剂，用它来萃取或富集有塔底不相溶的溶剂，用它来萃取或富集有塔底鼓出的气泡所吸附的表面活性物质。鼓出的气泡所吸附的表面活性物质。泡沫分离过程是利用待分离物质本身具泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性或能与表面活性剂结合在一有表面活性或能与表面活性剂结合在一起，在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得起，在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集，借气泡上升带出溶剂主体，达以富集，借气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。泡沫分离作用主要取决于组份在泡沫分
