1、 生物化学实验生物化学实验 上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心目目 录录v1.生物化学实验室规则生物化学实验室规则v2.生物化学实验基本操作生物化学实验基本操作v3.实验一实验一 3,5二硝基水杨酸比色定糖法二硝基水杨酸比色定糖法v4.实验二实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳v5.实验三实验三 总氮量的测定总氮量的测定微量凯氏微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法）定氮法 上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v6.实验四实验四 脂肪碘值的测定脂肪碘值的测定v7.实验五实验五 维生素维生素C的定量测定的
2、定量测定v8.实验六实验六 小麦萌发前后淀粉酶活力小麦萌发前后淀粉酶活力的比较的比较v9.实验七实验七 组织组织DNA的提取纯化的提取纯化v10.实验八实验八 酪蛋白的制备酪蛋白的制备 上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心生物化学实验室规则生物化学实验室规则（2课时）课时）v1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。不迟到，不早退，不大声谈笑。v2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器
3、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。的使用方法，否则不能开始实验。v3实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查签字同意，方可离开实验实。教师检查签字同意，方可离开实验实。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐
4、。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。能离开实验室。v5使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅自动手检修。自动
5、手检修。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！防发生事故！v7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。v8 仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。损坏仪器登记表，然后补领。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v9 实验
6、室内一切物品，未经本室负实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁携出室外，借物责教师批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。必须办理登记手续。v10每次实验课由班长负责安排值日每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验生。值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工室的安全、卫生和一切服务性的工作。作。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心生物化学实验基本操作生物化学实验基本操作（2课时）一一.玻璃仪器的洗涤玻璃仪器的洗涤在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻
7、璃仪器内壁应十分明亮光洁，无重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。水珠附着在玻壁上。常用的洗涤方法：常用的洗涤方法：v1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗少量蒸馏水冲洗23次，倒置在器皿架上晾干或置于次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。烘箱烤干备用。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，
8、不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡46小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。再用蒸馏水冲洗，最后干燥。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v3.粘附有血浆的刻度吸量管等
9、，有三种洗涤方粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：法：（1）先用）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；然后用自来水冲洗；（2）也可用）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液铬酸钾洗液46小时，再用大量自来水冲洗，小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗最后用蒸馏水冲洗23次。次。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v4.新购置
10、的玻璃仪器，应先置于新购置的玻璃仪器，应先置于12%稀盐酸稀盐酸溶液中浸泡溶液中浸泡26小时，除去附着的游离碱，再小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗23次。次。v5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意使用重铬酸钾洗液（以下简称洗
11、液）时应注意以下几点：以下几点：v1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。v2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或离子（可用稀硝酸或510%EDTA钠清除）。钠清除）。v3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容
12、器壁上附有大量油类、有机物失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。时，应先除去。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。或烧坏。v5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。成硫酸铬后不再具有氧化性。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物
13、科学实验教学中心 v重铬酸钾洗液的配制重铬酸钾洗液的配制:取重铬酸钾取重铬酸钾20g溶于溶于20ml蒸馏水中，加热至蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将沸。冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。注意：此时可产生高热。为防止容器边搅拌。注意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。当清洁效力降低时，再加入少量盖的容器中。当清洁效力降低
14、时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 二二.吸量管的使用吸量管的使用吸量管和定量吸吸量管和定量吸(移移)液器液器(微量加样器微量加样器)均为用来均为用来转移一定体积溶液的量器。转移一定体积溶液的量器。吸量管：吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：刻度吸量管：v刻度吸量管的种类：刻度吸量管的种类：上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v按容量规格来分，有按容量规格来分，有0.1、0.2、0.
15、25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的积可达移取量的0.11%。通常将管身标明的。通常将管身标明的总容量分刻为总容量分刻为100等分。因此，等分。因此，10ml的吸量管的吸量管一格代表一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。其余类推。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v按按“零零”点位置来分，有点位置来分，有“O”点在吸量管点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐点在吸量管下
16、端的（读数从下而上逐渐增大增大)。两种标示方法，在使用时各有方便之。两种标示方法，在使用时各有方便之处。处。v按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻我实验室的刻度吸量管全部是这一种度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻，另一种是刻度不刻到尖端的。到尖端的。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v刻度吸量管的正确使用方法：刻度吸量管的正确使用方法：用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖
17、端伸入试用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，
18、让尖端与容器内壁靠紧，松开需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。液体后再捻转一下吸量管移去）。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 使用刻度吸量管的注意事项：使用刻度吸量管的注意事项：v选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（应等于或略大于所需容积（ml数）。数）。v仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是
19、否包括仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？是从下而上？v拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。数。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球入空气产生气泡或管内试剂进入洗
20、耳球)，三，三是使用洗耳球是使用洗耳球(不可直接用口吸不可直接用口吸)。v按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v吸取粘滞性大的液体吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清如血液、血浆、血清等等)时，除选用合适的吸管时，除选用合适的吸管(奥氏管奥氏管)外，应注意外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用用食指压力控制食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。的最后一滴液体。v使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用
21、而使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免次，以免试剂被稀释。试剂被稀释。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v2.移液吸量管：移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半放出后，只需将吸量管的尖端触及
22、受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。分钟即可，不得吹出尖端的液体。v3.奥氏吸量管：奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。留在尖端的液体。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 定量吸定量吸(移移)液器液器(微量加样器微量加样器)：定量吸液器是定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。v1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品
23、速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。（只换吸嘴即可）。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 2.定量吸液器的类型：定量吸液器的类型：有两种类型。有两种类型。v固定式：固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。其规格有意调节取加样量。其规格有10l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、250l、300l、400l、500l、1000l等。等。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v可调式：可调式：在一定容量范围内可根据需要进行在一定容量范围内可根据需要进行调节取加
24、样量。例如规格为调节取加样量。例如规格为50200l的可调的可调式定量吸液器，可以在式定量吸液器，可以在50到到200l的范围内根的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60l、85l、110l、170l、200l等）。等）。一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。液器使用较为方便。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 3.定量吸液器的使用方法：定量吸液器的使用方法：v选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻
25、旋紧一下，以保证结合严密。管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。v持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。指轻轻放在吸液器的按钮上。v取样取样(吸液吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。取样即告完成。上饶师范学院上饶师范学院生物科
26、学实验教学中心生物科学实验教学中心 v排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。可释放按钮，使其恢复到初始位置。v吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来
27、水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。结束后集中仔细清洗。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 三三.溶液的混匀溶液的混匀 混匀的目的：混匀的目的：v使反应体系内的各种物质分子很好地互相接使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；触，充分进行反应；v使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 混匀的方法通常有以下几种：混匀的方法通常有以下几种：v使盛器作离心运动。使盛器作离心运动。v左手持试管上端
28、，用右手指轻击试管下半部，左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。使管内溶液作旋转运动。v利用旋涡混合（振荡）器混匀。利用旋涡混合（振荡）器混匀。v不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 混匀的注意事项：混匀的注意事项：v防止盛器内的液体溅出或被污染。防止盛器内的液体溅出或被污染。v严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 四四.离心机的使用离心机的使用 v离心法是分离沉淀的一种方法。它是
29、利用离心离心法是分离沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。因液体在在管底，以达到与液体分离的目的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 电动离心机的使用方法：电动离心机的使用方法：v1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。套管相匹配。v2.取出离心机
30、的全部套管，并检查套管底部是取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。之达到平衡。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分
31、别放将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心实验一实验一 3,5二硝基水杨酸比色定糖法二硝基水杨酸比色定糖法（8课时）课时）目
32、的和要求目的和要求v1.掌握掌握3,5二硝基水杨酸比色法定糖的原理二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。及方法。v2.用用3,5二硝基水杨酸定糖法测定样品中的二硝基水杨酸定糖法测定样品中的总糖及还原糖。总糖及还原糖。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 实验原理实验原理v3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。比色法可测知样品的含糖量。v该方法是半微
33、量测糖法，操作简便，快速，杂该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。质干扰较小。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 实验步骤实验步骤v一、葡萄糖标准曲线的绘制一、葡萄糖标准曲线的绘制取取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 将上述各管溶液混匀后，用将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。以葡萄糖浓度为横坐标，零点，记录光密度值。以葡萄糖浓度为横坐
34、标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 二、样品中总糖和还原糖含量的测定二、样品中总糖和还原糖含量的测定v1.样品中还原糖的提取：准确称取样品中还原糖的提取：准确称取2g样品，放样品，放入入100ml烧杯内，加入烧杯内，加入85乙醇乙醇50ml，混匀，混匀，在在50恒温水浴中保温恒温水浴中保温30min，过滤，滤渣，过滤，滤渣再用再用85乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水容量瓶中，用水定容，备用。定容，备用。上饶
35、师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v2.样品中总糖的水解及提取：准确称取样品样品中总糖的水解及提取：准确称取样品1g，放入大试管中，加入放入大试管中，加入1ml 6mol/L盐酸和盐酸和15ml蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时后，用蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾碘溶液检查水解程度，若已水解完全，碘化钾碘溶液检查水解程度，若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞指示剂则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞指示剂1滴。滴。以以10氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至并定容至100ml。再精确吸取上述溶液。再精确吸取上述溶液1
36、0ml，放入放入100ml容量瓶中，定容，备用。容量瓶中，定容，备用。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v3.样品中含糖量的测定：取样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别支大试管，分别按下表加入各种试剂：按下表加入各种试剂：上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心100%样品重量样品稀释倍数还原糖毫克数还原糖100%样品重量样品稀释倍数
37、水解后还原糖毫克数总糖量 思考题思考题v1.比色测定的操作要点是什么？方法的基本原比色测定的操作要点是什么？方法的基本原理是什么？理是什么？v2.72型分光光度计的原理及使用时的注意事项型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？是什么？v3.比色测定时为什么要设计空白管？比色测定时为什么要设计空白管？v4.总糖包括哪些化合物？总糖包括哪些化合物？上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心实验二实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（6课时）课时）目的和要求目的和要求v1.掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。v2.定量测定血清
38、中各种蛋白质的相对百分含量。定量测定血清中各种蛋白质的相对百分含量。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 实验原理实验原理采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有维素薄膜。
39、该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为强渗透性，厚度约为120m。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋应用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜电泳趋向于代替纸电泳。纤维薄膜电泳趋向于代替纸电泳
40、。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 实验步骤实验步骤一、仪器和薄膜的准备一、仪器和薄膜的准备v1.醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量
41、对电泳的结果影的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪扭不齐、响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于重各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。复等现象。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光
42、泽面。面和无光泽面。v2.制作制作“滤纸桥滤纸桥”：剪裁尽寸合适的滤纸条。取双层：剪裁尽寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为支架上，即为“滤纸桥滤纸桥”。按照同样的方法，在另。按照同样的方法，在另一个电泳槽的支架上制作相同的一个电泳槽的支架上制作相同的“滤纸桥滤纸桥”。它们。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的的作用是联系醋
43、酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间中间“桥梁桥梁”。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 v3.平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电泳槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状两个电泳槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡态。一般需要平衡1520min。注意，平衡后。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 二、点样二、点样在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端1.5处
44、。点样时，先用血色素吸管将处。点样时，先用血色素吸管将23微升微升的血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器的血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印印”在薄膜的点样区内（见下图）。注意。在薄膜的点样区内（见下图）。注意。应使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽应使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。环节之一。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中
45、心生物科学实验教学中心 上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 三、电泳三、电泳将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥滤纸桥”上，参照下图。平衡上，参照下图。平衡10min，仔细检查电，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后泳装置的线路是否正确，然后,通电。打开电源开头，通电。打开电源开头，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3mA，通电，通电1015min后，再将电压和电流
46、强度后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为提高到薄膜每厘米长度电压为10V左右，薄膜每厘米左右，薄膜每厘米宽的电流强度为宽的电流强度为0.40.6mA。在电泳过程中，应注。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约区带展开约3.5时，则并闭电源，一般通电时间为时，则并闭电源，一般通电时间为60min左右。左右。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 四、染色四、染色电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，电泳完毕立即取出
47、薄膜，直接浸入染色液中，染色染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右换一次漂洗液，连续更换三次，可左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 五、结果判断五、结果判断一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清
48、蛋白、从正极端起，依次为清蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和球蛋白和球蛋白。球蛋白。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 六、透明六、透明将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡中，浸泡2min后立即浸入透明液的乙液中，浸泡后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1min（要准（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约气泡。大约23min内的薄膜完全透明，放置内的薄膜完全透明，放置1015min后，后，用吹风
49、机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿用吹风机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约min后取出。再用干净的后取出。再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。纤维薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。上饶师范学院
50、上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 七、定量七、定量未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。量。上饶师范学院上饶师范学院生物科学实验教学中心生物科学实验教学中心 洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸入盛有浸入盛有0.4mol/L氢氧化钠溶液的试管中，清氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入蛋白管加入4ml，其余每管各加，其余每管各加ml，摇匀
