1、蛋白质工程与蛋白质组研究蛋白质工程与蛋白质组研究化学与生物工程学院主讲人：冉秀芝Tel：138832763581 1 克隆基因的表达克隆基因的表达1.11.1中的外源基因在大肠杆菌表达载体中的外源基因在大肠杆菌表达载体1.21.2在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题1.31.3真核细胞中重组蛋白的表达真核细胞中重组蛋白的表达图图1-1 1-1 在大肠杆菌中基因表达的在大肠杆菌中基因表达的3 3个重要信号个重要信号启动子 核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGAC
2、ATATAATPuPy-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区.CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A原核原核真核真核图图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表通过表达载体在大肠杆菌中被表达达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌图图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合杂交基因的构建和融合蛋白的合成成P R TP R T插入外源基因ATA TTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATA TTA
3、 GGA GCTGGA GC融合蛋白亲和层析法纯化 化学试剂除去大肠杆菌肽段 图图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录P R TT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止在真核细胞中表达重组蛋白在真核细胞中表达重组蛋白用酵母和丝状真菌表达重组蛋白（酿酒酵母）动物细胞中表达重组蛋白（哺乳动物、昆虫）利用活的动物和植物生产重组蛋白（生物体制药）图图1-6 1-6 真核细胞表达载体常用的真核细胞表达载体常用的4 4种启动子种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水
4、解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录图图1-7 1-7 将转基因体细胞的细胞核转入卵母细胞将转基因体细胞的细胞核转入卵母细胞卵母细胞体细胞DNA溶液移去细胞核移出细胞核植入代孕母亲体内从从植植物物中中获获得得重重组组蛋蛋白白u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；构的蛋白质；u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；之间的关系；u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白功能，设计合
5、成具有特定生物功能的全新蛋白质。质。2.2 蛋白质工程研究的主要内容蛋白质工程研究的主要内容 1、蛋白质工程的理论设计：蛋白质工程的理论设计：包括活性设计、专一性设计、框架（构象）包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。设计等。由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。蛋白质的修饰。如：如：异常血红蛋白异常血红蛋白的氨基酸取代的氨基酸取代 去羧基端去羧基端胰岛素胰岛素等。等。2.3 蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术不同动物胰岛素在不同动物胰岛素在A链中的差异
6、链中的差异 羧基端羧基端2、基因修饰、基因修饰点突变法点突变法 蛋白质结构的改变通过蛋白质结构的改变通过基因修饰基因修饰来完成来完成基因修饰的方法：基因修饰的方法：基因的全化学合成基因的全化学合成 按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成成结构基因、转录的起始信号及终止信号、结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。中进行目标蛋白质的表达。目前用此法已合成了：目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、人
7、血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因。等基因。调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶连接酶完整基因基因直接修饰法基因直接修饰法 将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去法去除一小段除一小段，然后用，然后用合成的核苷酸片段合成的核苷酸片段接上，接上，从而获得新的突变体。从而获得新的突变体。已修饰过的酶有：已修饰过的酶有：内酰胺酶、酪氨酰内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。还原酶等酶蛋白。限制性内切酶限制性内切酶外源外源DNA限制性内切酶限制性内切酶退火退火重组质粒重组质粒转化转化受体细
8、胞受体细胞筛选筛选表达表达带重组体的细胞带重组体的细胞目的产物目的产物质粒质粒目的基因目的基因酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸种不同氨基酸的突变体的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行进行“饱和性饱和性”分析。分析。酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒同时获得多个突变体同时获得多个突变体1、酶特性的改造、酶特性的改造改变酶的催化活性改变酶的催化活性酪氨酰酪
9、氨酰tRNA合成酶合成酶Thr5151Pro改造改造活力活力25倍倍改变酶的专一性改变酶的专一性枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶活性中心活性中心枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶活性中心活性中心SerCys（水解蛋白质）（水解蛋白质）改造改造水解硝基苯酯水解硝基苯酯专一性改变专一性改变2、药物设计、药物设计如抗病毒药如抗病毒药-干扰素干扰素稳定性的改进。稳定性的改进。-SH17SS形成二聚体失去活性失去活性-OH17氨基酸取代氨基酸取代二聚体二聚体二硫键二硫键 由于蛋白质工程可以由于蛋白质工程可以按按照人的意愿照人的意愿定向改造蛋白质定向改造蛋白质和酶和酶，必然有着广泛的前景！，必然有着广泛的前景！主讲
10、人：冉秀芝 化学与生物工程学院E-mail:u重组药物的生产u人类疾病相关基因的识别和鉴定u基因治疗3.1重组药物的生产重组药物的生产3.1.1重组胰岛素3.1.2在大肠杆菌中合成人生长素3.1.3重组凝血因子3.1.4其他人类蛋白质的合成3.1.5重组疫苗图图3-13-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程30个氨基酸B链21个氨基酸A链胰岛素利于重组生产的特点前导序列BCA前胰岛素原（胰岛素原=BCA无前导序列）胰岛素SSSSBA剪切-S-S-S-S-LBAC自发折叠图图3-2 3-2 由人工合成的由人工合成的A,BA,B链的
11、基因合成重组胰岛素链的基因合成重组胰岛素lac启动子lacZA基因运载人工合成的A基因的 载体B基因运载人工合成的B基因的 载体(a)人工合成的基因(b)合成胰岛素蛋白ABmet-半乳糖苷酶片段A链胰岛素纯化A链和B链二硫键连接metB链溴化氰处理pBR322pBR322转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白图图3-33-3重组促生长素抑制素的合成重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ人工促生长素抑制素基因met-半乳糖苷酶片段促生长素抑制素融合蛋白转化大肠杆菌促生长素抑制素（14氨基酸）溴化氰图图3-43-4重组生长素的合成重组生长素的合成密码子01911912424024Hae保留除去（a）
12、生长素cDNA片段的准备过程（b）表达024合成前导序列191cDNAlac启动子插入表达载体合成生长素转化大肠杆菌图图3-5 3-5 凝血因子凝血因子基因及其翻译产物基因及其翻译产物外显子（26）内含子（25）（a）凝血因子基因（b）凝血因子的翻译后的加工初级翻译产物（2351个氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子蛋白加工重组凝血因子重组凝血因子合成的几种方法合成的几种方法在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）利用活体动物生产（猪）利用表达载体Ag启动子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子的cDNA导入仓鼠细胞重组蛋白干扰素的合成干扰素的合成图图3-7 3-7 利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理利用分离的病
13、毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体蛋白壳体蛋白的特异抗体注射到血液循环抗体包围整个病毒被完整病毒感染转基因植物生产重组蛋白疫苗转基因植物生产重组蛋白疫苗HbsAg麻疹病毒呼吸道合胞病毒集几种疫苗于一体图图3-8 3-8 重组牛痘病毒可能用途的基本原理重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒启动子重组牛痘病毒基因组牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗体抗牛痘病毒抗体注射重组牛痘病毒颗粒到血液循环免疫系统合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗体表表3-2 3-2 在重组牛痘病毒中表达的外源基因在重组牛痘病毒中表达的外源基因 基 因恶性疟原虫表面抗原流行性感冒病毒衣壳蛋白狂犬病病毒G蛋白乙
14、型肝炎主要表面抗原单纯疱疹糖蛋白人类免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣壳蛋白仙台病毒蛋白BACKBACK3.23.2人类疾病相关基因的识别和鉴定人类疾病相关基因的识别和鉴定3.2.1 遗传性疾病基因识别的重要3.2.2 如何识别遗传病基因基因的识别为治疗遗传性疾病提供生物化学基础，并为进一步设计药物提供依据识别缺陷基因中发生的突变，用来设计筛选程序，检测缺陷基因携带者的突变基因遗传疾病相关基因的识别是进行基因治疗的先决条件两个紧密连锁的基因几乎总是一起传给下一代图图3-9 3-9 连锁和非连锁基因的遗传形式连锁和非连锁基因的遗传形式ABABABabababABabABA babab重组
15、产物A Ba ba bA BA ba B（a）连锁基因（c）在不同染色体上的基因（b）在同一染色体上相距很远的基因在同一条染色体上，相距很远的两基因常常同时遗传，但重组会使它们分开在不同染色体上的两个基因随机分离如图所示为3个家族代表男性代表女性图图3-10 3-10 乳腺癌基因图谱分析乳腺癌基因图谱分析D17S7417号染色体（80Mb）D17S1325D17S1321BRCA1Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1
16、.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFP分析法分析法53引物引物1引物引物299 bp43 bpBcl I因子因子VIII 基因基因142 bp 片段片段142 bp99 bp43 bp异常带异常带先症者先症者胎儿胎儿BACKBACK3.3 3.3 基因治疗基因治疗3.3.1遗传病的基因治疗3.3.2基因治疗与癌症3.3.3基因治疗带来的伦理问题图图3-11 3-11 转染干细胞的分化，使所有成熟血细胞都含有新的基因转染干细胞的分化，使所有成熟血细胞都含有新的基因分离的干细胞新基因感染重新植入分化
17、T细胞B细胞嗜碱性粒细胞嗜酸性粒细胞中性性粒细胞单核细胞4 植物基因工程的研究植物基因工程的研究基因克隆和DNA分析在农业中的应用化学与生物工程学院冉秀芝83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02FirsttransgenicplantDelay-ripening tomatoCommercialized in the USFirst field testsHerbicide resistant,insect resistant plants commercializedGM maize approved by EU
18、First Bt corn plants Rotting resistant tomato approved by FDA图图4-1 植物基因工程的发展迅速植物基因工程的发展迅速植物基因工程研究植物基因工程研究植物基因组计划植物基因组计划植物分子育种植物分子育种高产、优质、高效和多抗性高产、优质、高效和多抗性植物作为反应器植物作为反应器香蕉、马铃薯、番茄等香蕉、马铃薯、番茄等玉米、棉花、大豆、高粱和番茄玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工业酶等酒精、石油、工业酶等主要研究应用的领域主要研究应用的领域u4.1.1培育抗虫植物u4.1.2抗除草剂作物u4.1.3其他利用基因添加的例子传统杀虫
19、剂与理想杀虫剂传统杀虫剂与理想杀虫剂常有残留范围局限性可生物降解范围广广谱性选择性图图4-2-4-2-内毒素的作用方式内毒素的作用方式-内毒素基因无活性的原毒素有活性的病毒在细菌中表达在昆虫内脏中被蛋白酶消化破坏内脏上皮细胞图图4-3 4-3 基因工程改造玉米的重要步骤基因工程改造玉米的重要步骤启动子聚腺苷酸化序列（b）连上启动子序列和聚腺苷酸化信号1 1155B.thuringiensis29 607玉米偏好密码子和GC含量（a）人工合成-内毒素基因人工合成的基因(c)PCR分析成熟的植物在叶绿体中合成-内毒素基因阻止昆虫对-内毒素的抗性（三种策略，图15.5）辅助蛋白CrtA(a2)BAC
20、K图图4-44-4草甘膦作用机制草甘膦作用机制烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸（EPSP）色氨酸（Trp）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）莽草酸EPSPS烯醇丙酮酸草甘膦竞争EPSPS改造，增强抗性草甘膦降解“抗农达抗农达”作物作物含抗草甘膦的含抗草甘膦的EPSPSEPSPS农杆菌CP4株系的EPSPS叶绿体叶绿体转移技术生物导弹克隆到Ti质粒融合蛋白表达导入新一代草甘膦抗性作物新一代草甘膦抗性作物利用利用GATGAT降解草甘膦降解草甘膦3个天然的GAT基因多基因改造（multigene shuffling）新的GAT基因酶的活力增强10000倍BACK表表4-1 4-1 植物基因添加的例子植物基
21、因添加的例子基因组织来源经过改良的植物被赋予的特征葡聚糖酶紫花苜蓿抗真菌卫星RNAs各种病毒抗病毒乙酰乳酸合酶烟草抗除草剂DNA腺嘌呤甲基化酶大肠杆菌雄性不育富甲硫氨酸蛋白巴西坚果改善硫含量奇异果甜蛋白西非竹竽甜味二氢黄烷醇还原酶矮牵牛调节花的颜色4.2 4.2 基因消减基因消减u4.2.1反义技术的原理u4.2.2反义RNA与耐贮藏转基因番茄u4.2.3在植物基因工程中利用反义RNA的其他例子图图15.8 15.8 反义反义RNARNA启动子反向基因反义RNA与原来的mRNA正好反向互补启动子正向基因mRNA转录转录图图15.9 15.9 反义反义RNARNA抑制基因表达可能的原理抑制基因表
22、达可能的原理mRNA反义RNAmRNA反义RNA被核糖核酸酶降解？不能与核糖体连接？BACK图图15.1115.11使用反义使用反义RNARNA抑制多聚半乳糖醛酸酶抑制多聚半乳糖醛酸酶反义多聚半乳糖醛酸酶基因启动子聚腺苷酸化序列限制性酶切，连接到反向调控序列R多聚半乳糖醛酸酶基因RTi质粒载体pBIN19根瘤农杆菌转化体番茄茎部插入转化感染筛选培育转基因植株使用反义使用反义RNA抑制乙烯合成抑制乙烯合成抑制抑制合成酶合成酶策略同图15.11氨基环丙烷羧酸BACK表表15.3 15.3 植物基因敲除的例子植物基因敲除的例子目的基因改变的特征多聚半乳糖醛酸酶延缓番茄果实的腐烂氨基环丙烷羧酸脱氨酶调
23、节番茄果实的成熟多酚氧化酶防止蔬菜和水果的变色淀粉合成酶减少蔬菜内淀粉的含量-12去饱和酶大豆内的高油酸含量查耳酮合成酶改变各种观赏植物的花色15.3 15.3 转基因植物的问题转基因植物的问题u15.3.1选择性标记的安全性u15.3.2终止技术u15.3.3转基因植物可能对环境产生危害图图4-5 Cre4-5 Cre重组酶对重组酶对DNADNA的剪切的剪切Cre的目的序列Cre催化重组目的序列片段被剪切掉图图4-6 4-6 终止技术终止技术RIP基因（a）RIP基因核糖体失活蛋白阻断蛋白合成（b）终止系统Cre Cre阻断DNA胚启动子Cre重组酶基因四环素启动子Cre重组酶四环素产生功能性RIP植株启动子被激活长为成熟植株合成核糖体失活蛋白
