1、大蒜总黄酮提取及纯化研究大蒜总黄酮提取及纯化研究 目目 录录一、研究目的与意义一、研究目的与意义二、国内外研究现状二、国内外研究现状三、研究的主要内容三、研究的主要内容四、实验结论四、实验结论一、研究目的及意义一、研究目的及意义 大蒜在我国资源丰富，但国内大蒜加工产大蒜在我国资源丰富，但国内大蒜加工产业链过于简单，大蒜出口更多集中在初中级业链过于简单，大蒜出口更多集中在初中级产品上，多以鲜蒜销售为主，深加工产品非产品上，多以鲜蒜销售为主，深加工产品非常少，因此经济效益也相对较低。常少，因此经济效益也相对较低。大蒜中的功效成分为大蒜素、黄酮类化合大蒜中的功效成分为大蒜素、黄酮类化合物等。大蒜具有
2、强力杀菌、预防肿瘤和癌症物等。大蒜具有强力杀菌、预防肿瘤和癌症、降血压、降胆固醇、降血脂、抗衰老、抗、降血压、降胆固醇、降血脂、抗衰老、抗疲劳、抗血栓形成、预防糖尿病、保护心血疲劳、抗血栓形成、预防糖尿病、保护心血管等功能。管等功能。研究表明，大蒜中含有黄酮类化合物，在研究表明，大蒜中含有黄酮类化合物，在中国知网中有中国知网中有6 6篇关于大蒜黄酮提取的文章篇关于大蒜黄酮提取的文章,其中张泽英采用乙醇回流提取法提取大蒜总其中张泽英采用乙醇回流提取法提取大蒜总黄酮得率黄酮得率0.97%0.97%。而本实验采用超声波辅助。而本实验采用超声波辅助乙醇提取法提取大蒜中黄酮的得率为乙醇提取法提取大蒜中黄
3、酮的得率为1.24%1.24%。其得率有所提高，所以具有一定的研究意。其得率有所提高，所以具有一定的研究意义。义。本实验对提取的粗黄酮进行纯化，得到的本实验对提取的粗黄酮进行纯化，得到的大蒜黄酮与研究比较多的大蒜素相比没有刺大蒜黄酮与研究比较多的大蒜素相比没有刺激性气味，将来可以作为功能性食品的基础激性气味，将来可以作为功能性食品的基础原料。所以说大蒜黄酮的研究前景较大。原料。所以说大蒜黄酮的研究前景较大。二、国内外研究现状二、国内外研究现状 大蒜这一被世界许多国家视为珍品的物产，大蒜这一被世界许多国家视为珍品的物产，在我国却一直未能被真正形成产业开发。在我在我国却一直未能被真正形成产业开发。
4、在我国大蒜主要以提取大蒜素为主要研究对象，而国大蒜主要以提取大蒜素为主要研究对象，而大蒜素（三硫二丙烯）可以通过化学合成得到。大蒜素（三硫二丙烯）可以通过化学合成得到。国外对大蒜的研究也给予了高度的重视，从国外对大蒜的研究也给予了高度的重视，从药理、临床、应用等各个领域进行了比较深入药理、临床、应用等各个领域进行了比较深入系统的研究，进一步证明了大蒜不仅是一种优系统的研究，进一步证明了大蒜不仅是一种优良的保健食品，而且是一种具有广泛用途的天良的保健食品，而且是一种具有广泛用途的天然药品然药品。三、研究的主要内容三、研究的主要内容3.1 大蒜总黄酮提取工艺的确定大蒜总黄酮提取工艺的确定3.2 大
5、蒜总黄酮的纯化工艺研究大蒜总黄酮的纯化工艺研究3.3 大蒜纯化样品的紫外光谱和大蒜纯化样品的紫外光谱和 红外光谱分析红外光谱分析3.4 精制大蒜黄酮的活性研究精制大蒜黄酮的活性研究3.1 大蒜总黄酮提取工艺的确定大蒜总黄酮提取工艺的确定3.1.1大蒜总黄酮提取方法的选择大蒜总黄酮提取方法的选择 超声波辅助乙醇提取法，其得率最高，所以超声波辅助乙醇提取法，其得率最高，所以本实验采取超声波辅助乙醇提取法。本实验采取超声波辅助乙醇提取法。3.1.2 大蒜总黄酮的提取工艺流程大蒜总黄酮的提取工艺流程 3.1.3 芦丁标准曲线的绘制芦丁标准曲线的绘制 标准曲线的回归方程为：标准曲线的回归方程为：Y=10
6、.325X0.0100，R2=0.9995，表明了芦丁在浓度，表明了芦丁在浓度0-0.05mg/ml之内线之内线性关系最好。性关系最好。0.010.020.030.040.050.10.20.30.40.50.6吸光度（A）溶液浓度mg/ml图3-1 芦丁标准曲线 3.1.4 单因素实验单因素实验图3-2 超声波作用时间对提取效果的影响 图3-3 不同料液比对提取效果的影响图3-4 提取时间对提取效果的影响 图3-5 乙醇浓度对总黄酮得率的影响通过单因素试验确定了超声波辅助通过单因素试验确定了超声波辅助乙醇回流提取法的最佳条件：超声波处乙醇回流提取法的最佳条件：超声波处理理20min，料液比料
7、液比1:19，提取时间提取时间2h，乙乙醇体积分数醇体积分数85%，提取温度提取温度70。3.1.5 响应面实验结果分析响应面实验结果分析 表表3-2 3-2 响应面因素水平表响应面因素水平表 水平水平因因 素素料液比料液比乙醇浓度（乙醇浓度（%）温度（温度（）-11:16806501:18857011:2090753.1.6 响应面实验结果分析响应面实验结果分析 表表3-3 3-3 响应面试验测定结果分析表响应面试验测定结果分析表 3.1.7 各因素之间的响应面图各因素之间的响应面图 图3-7 提取温度与料液比的相互作用的影响 图3-9 提取温度与乙醇浓度的相互作用的影响图3-8 乙醇浓度与
8、料液比的相互作用的影响 各个因素经回归拟合后，选择对响应值显各个因素经回归拟合后，选择对响应值显著的各项可以得到大蒜总黄酮得率度编码自变著的各项可以得到大蒜总黄酮得率度编码自变量（提取温度、提取时间、液料比）的二次多量（提取温度、提取时间、液料比）的二次多项回归方程为项回归方程为：Y=+0.22-4.750E-003*A+0.014*B+3.750E-003*C-3.500E-003*A*B+1.000E-003*B*C-0.071*A2-0.073*B2-0.073*C2以上三个响应面立体图直观地给出了各以上三个响应面立体图直观地给出了各个因子交互作用后对总黄酮得率的影响个因子交互作用后对总
9、黄酮得率的影响的直观图。的直观图。在所选的范围内存在极值，在所选的范围内存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。提取温度、乙醇浓最小椭圆的中心点。提取温度、乙醇浓度及料液比对大蒜总黄酮的提取效果都度及料液比对大蒜总黄酮的提取效果都是有影响的，提取温度与提取时间的交是有影响的，提取温度与提取时间的交互作用影响较大互作用影响较大，在响应曲面图中表现在响应曲面图中表现为曲面坡度大，变化较明显。为曲面坡度大，变化较明显。3.1.8 响应面优化响应面优化响应面分析表明，最佳提取工艺理论值：提响应面分析表明，最佳提取工艺理论值：提取温度取温度66.6
10、8，料液比，料液比1:18.98，乙醇浓度，乙醇浓度81.94%。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：正为：提取温度提取温度67，料液比为，料液比为1:19，乙醇，乙醇浓度浓度80%。试验验证：在此条件下重复试验验证：在此条件下重复5次进行验证试次进行验证试验，大蒜总黄酮得率可验，大蒜总黄酮得率可由由1.26%上升到上升到1.32%。3.2 大蒜总黄酮的纯化工艺研究大蒜总黄酮的纯化工艺研究图3-10 大蒜黄酮的纯化样品及实验装置3.2.1 大孔吸附树脂的选择结果分析大孔吸附树脂的选择结果分析 由表由表3-4得效果最佳的是得效果最佳的是AB-8树脂，
11、所以试验树脂，所以试验选用选用AB-8树脂对大蒜总黄酮进行纯化。树脂对大蒜总黄酮进行纯化。3.2.2 乙醇浓度对解析效果的影响乙醇浓度对解析效果的影响 由图由图3-11可看出，吸附饱和的树脂用可看出，吸附饱和的树脂用65%65%左右左右的乙醇水溶液进行解析，黄酮解析速度较快且效的乙醇水溶液进行解析，黄酮解析速度较快且效果较好。果较好。3.3 纯化样品的紫外光谱及红外光谱分析纯化样品的紫外光谱及红外光谱分析 3.3.1 紫外光谱分析 可以清晰的看到在可以清晰的看到在440nm左右出现明显的吸收峰，也左右出现明显的吸收峰，也是大蒜中黄酮的特征峰。是大蒜中黄酮的特征峰。400600800-10123
12、45311235271吸光度（A）波长（nm）443 查阅相关文献黄酮类化合物的紫外可见吸收查阅相关文献黄酮类化合物的紫外可见吸收波段波段 从表从表3-5大蒜中黄酮的特征峰吸收峰的波大蒜中黄酮的特征峰吸收峰的波段在段在330nm到到430nm之间，可以初步得出大蒜之间，可以初步得出大蒜中含有的中含有的主要黄酮类化合物为橙酮类主要黄酮类化合物为橙酮类。项目带(nm)带(nm)黄酮类250280310380黄酮醇类250280330360异黄酮类245275310330肩峰双氢黄酮类275295300330肩峰查尔酮类230270340390橙酮类230270340450花色素类270280465
13、560表3-5 黄酮类化合物的紫外可见吸收波段3.3.2 红外吸收光谱图分析红外吸收光谱图分析 查阅文献，查阅文献，1631cm-1为为C=O的的吸收特征峰；吸收特征峰；1501 cm-1为为C=C双键双键的伸缩振动吸收；的伸缩振动吸收；1600 cm-1为苯基为苯基特征吸收峰；特征吸收峰；11891071 cm-1为醇为醇类吸收峰，可以作为判断醇类化合类吸收峰，可以作为判断醇类化合物的依据；物的依据；885746 cm-1为苯环四为苯环四取代；可初步确定符合橙酮类的基取代；可初步确定符合橙酮类的基本结构。本结构。3.4 精制大蒜黄酮的生物活性研究精制大蒜黄酮的生物活性研究3.4.1 大蒜黄酮
14、的抗氧化性分析大蒜黄酮的抗氧化性分析 实验原理：实验原理：利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由基利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由基（O2-）的生成，的生成，O2-与某些化合物的作用，产生具有特定吸与某些化合物的作用，产生具有特定吸收的有色物质，利用分光光度计进行测定。受试物若能清收的有色物质，利用分光光度计进行测定。受试物若能清除除O2-，则吸光度发生变化，可间接判断受试物对，则吸光度发生变化，可间接判断受试物对O2-的抑的抑制作用。制作用。计算抑制率：计算抑制率：抑制率（）（抑制率（）（A1/t-A2/t）/A1/t*100%由表由表3-6得邻苯三酚自氧化速率得邻苯三酚自氧化速率
15、A1/t=8.4210-3 由表由表3-7可以得到加入浓度为可以得到加入浓度为0.1g/ml、0.2g/ml样品液样品液大蒜黄酮样品后邻苯三酚自氧化平均速率大蒜黄酮样品后邻苯三酚自氧化平均速率A2/t=3.9010-3可以计算得抑制率可以计算得抑制率=53.68表表3-3-7 7 每隔每隔30s30s所测加入大蒜黄酮样品后邻苯三酚自氧化的吸光度所测加入大蒜黄酮样品后邻苯三酚自氧化的吸光度时间（s）0306090120150180加入大蒜黄酮后邻苯三酚自氧化速率（10-3）10.3020.4040.5150.6670.8080.8981.0123.9420.2970.3980.4270.5780
16、.7580.8820.9913.863.4.2 大蒜黄酮的抑菌效果分析大蒜黄酮的抑菌效果分析 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热链球金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌同为革兰氏阳性菌，而大肠杆菌为革兰氏阴性菌同为革兰氏阳性菌，而大肠杆菌为革兰氏阴性菌，可以得出大蒜中的黄酮类化合物具有广谱的菌，可以得出大蒜中的黄酮类化合物具有广谱的抑菌效果。抑菌效果。表3-8 大蒜黄酮对各菌种抑制效果四、实验结论四、实验结论（1）通过用水提法，乙醇回流提取法，超声波辅助）通过用水提法，乙醇回流提取法，超声波辅助乙醇回流提取法对大蒜中黄酮提取的比较后，确乙醇回流提取法对大蒜中黄酮提取的比较后，确定超声波辅助
17、乙醇回流提取法为最佳提取方法。定超声波辅助乙醇回流提取法为最佳提取方法。（2）通过单因素实验以及响应面设计实验优化。确）通过单因素实验以及响应面设计实验优化。确定大蒜总黄酮的最佳提取工艺定大蒜总黄酮的最佳提取工艺:提取温度提取温度67，料，料液比液比1:19，乙醇浓度，乙醇浓度80%，验证结果显示大蒜总，验证结果显示大蒜总黄酮得率为黄酮得率为1.32%。（3）通过分析选用通过分析选用AB-8大孔吸附树脂纯化，用大孔吸附树脂纯化，用65%乙醇进行洗脱，浓缩干燥后得精制黄酮。乙醇进行洗脱，浓缩干燥后得精制黄酮。（4）通过紫外光谱及红外光谱实验初步确通过紫外光谱及红外光谱实验初步确定大蒜黄酮主要为橙酮类。定大蒜黄酮主要为橙酮类。（5）通过抗氧化性实验证明大蒜总黄酮确通过抗氧化性实验证明大蒜总黄酮确实具有抗氧化性，大蒜黄酮对超氧阴实具有抗氧化性，大蒜黄酮对超氧阴离子自由基（离子自由基（O2-）的平均抑制率）的平均抑制率54%左右。同时抑菌实验证明大蒜中黄酮左右。同时抑菌实验证明大蒜中黄酮具有一定的抑菌作用，大蒜中的黄酮具有一定的抑菌作用，大蒜中的黄酮类化合物类化合物具有广谱的抑菌效果。具有广谱的抑菌效果。
