1、第七章第七章 生物技术在动物育种中的应用生物技术在动物育种中的应用第一节 繁殖生物技术的应用动物优良性状动物优良性状遗遗 传学传学育种学育种学繁殖学繁殖学性状遗传参数选择优良性状扩大优良性状一、人工授精n一、概述n1、动物的配种方法自由交配分群交配围栏交配人工辅助交配人工授精2、人工受精意义n（1）精液可以长期保存和运输n（2）扩大优良种公畜的利用率，加速品种改良n（3）能够适时配种，提高母畜受胎率n（4）减少公畜饲养头数,提高经济效益n（5）克服因品种、体格等差异造成的交配问题n（6）可避免疫病的传播使用人工授精与自然交配成本比较3、发展概况n1780年，意大利科学家巴拉扎尼首先用于狗并获得
2、成功n20世纪4060年代，发展迅速n我国1935年首先在江苏开展马的人工授精并获得成功n我国在60年代后发展极为迅速n“小康”社会，人均畜产消费将比现在提高1.5倍，人工授精技术全面普及n人工授精在奶牛业的发展最快，目前多数国家已普及了对奶牛的冷冻精液人工授精。n猪的人工授精在20世纪90年代得到较快的普及。4、人工授精技术的基本技术环节n包括：公畜的采精、精液品质检查、精液的稀释、精液的保存（液态保存、冷冻保存)、冷冻精液的解冻与检查、精液的运输、输精等。（1）器械消毒n凡是用于人工授精的器械都要严格消毒n物理消毒：煮沸、蒸气、干热、紫外线n化学消毒：化学药品动物输精器（2）精液品质检查n
3、常规检查项目：n精液量：一次射精数量：牛5-8.马60-100.猪200-300.羊0.8-1.2n色泽：乳白或乳黄n气味：无味，偏腥nPH值：即精液酸碱度n云雾状：牛.羊精子密度大,混浊不透明,如翻腾滚滚的云雾。n活率：直线前进运动精子的百分率n密度：每毫升精液中精子数定期检查项目n（1）形态检查：形态是否正常。（畸形率、顶体异常）n（2）精子生物化学检查：耗氧量，果糖分解，美兰褪色等。n（3）精子抗性测定：对酸碱滴定抵抗力、抗冲击、抗温等n（4）存活时间与存活指数n（5）细菌学检查n（6）复苏率n（7）死活精子检查（3）精液的稀释与保存精液的稀释与保存n稀释的目的稀释的目的：n扩大精液量n
4、延长精子的寿命n利于保存n抑制微生物稀释液的主要成分和生理作用稀释液的主要成分和生理作用nA、稀释剂：主要扩大精液容量。nB、营养剂：主要是提供营养：葡萄糖.果糖.乳糖.鲜奶.卵黄nC、保护剂：主要保护精子免受不良因素的危害n a.缓冲物质：适当的PH值。n b.非电解质和弱电解质：降低精清中电解质浓度的作用。n c.防冷刺与抗冻保持质：防冷休克和增强抗冻力。n 防冷：缩醛磷脂等。抗冷：甘油.二甲基亚矾等。n d.抗菌物nD、其他添加剂：酶类、激素类、维生素类等，有利于改善精子所处的环境，以提高受精机会。精液的保存方法精液的保存方法n常温保存常温保存：15-25 存活3-7天n低温保存低温保存
5、：0-5 存5-9天n超低温保存超低温保存：-196颗粒法、塑料细管（也叫精液的冷冻保存）细管冻精分装机细管冻精分装机0.25ml或或0.5ml/支支 输精输精二、胚胎移植(Embryo transfer，ET)n胚胎移植：将从良种母畜体内取出的早期胚胎，或者是由体外受精及其他方式获得的胚胎，移植到同种的生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体。n供体(Donor)：提供胚胎的母畜n受体(Recipient)：接受胚胎的母畜1、胚胎移植在畜牧生产上的意义n（1）分发挥优良母畜的遗传资源和提高畜群的品质n（2）缩短世代间隔，是家畜育种的量要手段n（3）可提高肉畜的双胎率n（4）可代替活畜的
6、引进n（5）保存品种、物种资源n（6）重要的研究手段2、胚胎移植的技术程序n胚胎移植包括：同期发情、超数排卵、胚胎收集、胚胎品质评定、胚胎的体外保存和移植等。胚胎胚胎移植移植程序程序示意示意图图种种公公牛牛供体母牛供体母牛受体母牛受体母牛同期发情同期发情超超排排配种配种回收回收胚胎胚胎发发情情移移植植胚胚胎胎胚胎质量检查胚胎质量检查34个月之后可再个月之后可再次超排或正常配种次超排或正常配种（1）供体和受体母畜的选择n供体母畜：健康，应有较高的育种价值，生殖机能正常，对超数排卵反应好的母畜。n受体母畜：每头供体需要准备数头受体。受体母畜选择健康、繁殖性能良好，体型较大的普通（地方）母畜。同期发
7、情同期发情n同期发情是利用某些激素制剂，人为地控制并同期发情是利用某些激素制剂，人为地控制并调整一群雌性动物发情周期的过程，使之在预调整一群雌性动物发情周期的过程，使之在预定的时间内集中发情，以便有计划地合理组织定的时间内集中发情，以便有计划地合理组织配种。配种。n意义有意义有:有利于开展人工授精，能更广泛地应有利于开展人工授精，能更广泛地应用冷冻精液便于合理组织大规模生产和科学化用冷冻精液便于合理组织大规模生产和科学化管理，节省人力、物力，提高繁殖率管理，节省人力、物力，提高繁殖率;应用同应用同期发情可使供体母畜和受体母畜处于相同的生期发情可使供体母畜和受体母畜处于相同的生理状态，有利于胚胎
8、移植时胚胎的生长发育。理状态，有利于胚胎移植时胚胎的生长发育。（2）超数排卵(Superovulation)n在母畜发情周期的间情期，注射促性腺激素（如FSH或PMSG）促使卵巢多数卵泡发育并排卵。n超排于牛、羊这样的单胎动物效果明显，对于产多胎的猪意义不大。马对超数排卵的反应很差。n就胚胎质量而言，每侧卵巢排610个卵母细胞最合适。（3）供体母畜的配种n经过超效排卵处理的母畜发情后应适时配种。n为了得到较多的发育正常的胚胎，应使用活率高、密度大的精液，而且将授精次数增加到23次，间隔810h。（4）胚胎的收集n利用冲洗液将胚胎由生殖道冲出，收集在器皿内。n家畜的胚胎收集一般在配种38d后，发
9、育至48细胞以上为宜。牛胚胎最好在桑椹胚或早期囊胚阶段收集和移植，一般在配种68d后进行。（5）胚胎评定n正常的胚胎，卵裂球外形整齐清晰，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄一致。n胚胎经鉴定后分为A，B，C三个等级。nA，B级胚胎为可用胚胎，C级为不可用胚胎。（6）胚胎的保存和培养n异种活体保存大量的实验证明，免的输卵管比较适于其他动物的胚胎发育。n常温保存在1525下于培养液中保存,能保存24h,用于短暂的保存和运输。n低温保存在510胚胎卵裂暂停，新陈代谢速度显著变慢，但尚未停止。n超低温保存（7）胚胎移植n同采集胚胎一样，胚胎移植也有手术法和非手术法两种方式。三、克隆n定义：定
10、义：n克隆（克隆（cloneclone）即无性繁殖，是不经过）即无性繁殖，是不经过两性生殖细胞结合而产生的新的生物体。两性生殖细胞结合而产生的新的生物体。n克隆有两个特点：克隆有两个特点：n克隆个体间的遗传物质完全相同，即克隆个体间的遗传物质完全相同，即有相同的基因型有相同的基因型n这种相同基因型的个体可以无限增殖。这种相同基因型的个体可以无限增殖。、克 隆 发展简史n早在1938年 Spemann的工作已证明,从螈蝾胚胎的很多细胞中选出一个核都有可能发育成一个成年个体。n1952年,Briggs和King等应用中国林蛙通过细胞核移植获得遗传上完全相同的脊椎动物。n1965年,我国著名科学家童
11、第周应用细胞核移植获得了核移植鱼,证明了鱼类获得无性繁殖系的可行性。n哺乳动物,Robl等(1986)的工作取得了突破性的进展,他把小鼠2细胞期胚胎的分裂球移入去除原核的受精卵内,然后移入一个假孕母鼠,结果产生了正常胎几。n从此以后家畜的细胞核移植工作也进入了一个重要的发展时期。n1986年，Willadsen首先进行绵羊胚胎细胞核移植，获得了核移植绵羊。n1987年，Robl等获得了核移植牛；1988年，Stice等得到了核移植兔。1989年，Prather获得核移植猪。n1993年，Stice等报道了用胚胎细胞连续核移植在牛上获得成功。n体细胞核移植的工作从1970年起开始进行，首先由英国
12、科学家Gurdon 在两栖动物上开 始 研 究，产生了30只白化的小青蛙，当时在科学界引起了轰动。n2019年，Campbell等利用传代绵羊胚盘细胞作为供核细胞产生了克隆绵羊。Author cloned animal cell typeSchnieke AK 2019 sheep fetal fibroblast 35dCibelli JB 2019 cow fetal fibroblast 55dVignon X 2019 cow fetal fibroblast 60dBaguisi A 2019 goat fetal fibroblast 35dWang YG 2019 goat fe
13、tal fibroblast 30dShiga K 2019 bull muscle cellsYang XZ 2000 calf fibroblast from earAkira O 2000 pig fetal fibroblast 24d2019年，出生的世界上第一只体细胞克隆绵羊，取名为“多莉”（Dolly）2年后的克隆羊多利美国科学家研究获得的胚胎细胞克隆猴2019年，Cibelli等也用转染外源基因的胎儿成纤维细胞获得了克隆牛。（George and charles）2019年，Schnieke等用转染外源基因的胎儿成纤维细胞核移植，获得者了转基因克隆绵羊。（波利波利）日本2019
14、年出生的成年体细胞克隆牛美国康乃尔大学美籍华裔科学家杨向中教授用牛耳细胞克隆小牛成功，这是出生一个多月后的克隆牛“艾米”和基因牛“艾斯本”。美国康州大学杨向中教授获得的克隆牛。Calves cloned from fibroblast of old bull 体细胞克隆小鼠克隆和再克隆小鼠Cloned Piglets produced in PPL Incorporation picture from Nature扬州大学与中科院合作得到的克隆羊n1989年获得胚胎细胞克隆山羊年获得胚胎细胞克隆山羊n1992年获得胚胎细胞连续克隆山羊年获得胚胎细胞连续克隆山羊n2019年获得胎儿成纤维细胞克隆
15、山羊年获得胎儿成纤维细胞克隆山羊n2019年获得成年转基因羊体细胞克隆山羊年获得成年转基因羊体细胞克隆山羊n2000年获得转基因的体细胞克隆山羊年获得转基因的体细胞克隆山羊、克隆的方法n（）胚胎分割n（）细胞核移植细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植胎儿细胞核移植胎儿细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植细胞核移植分以下几个步骤：细胞核移植分以下几个步骤：n卵母细胞的获得和去核卵母细胞的获得和去核n供核细胞的培养或分离供核细胞的培养或分离n细胞核移入去核卵母细胞细胞核移入去核卵母细胞n细胞融合和激活细胞融合和激活n胚胎培养胚胎培养n胚胎移植胚胎移植克隆绵羊的制备过
16、程转转 基基 因因 克克 隆隆 羊羊 技技 术术 路路 线线DNA提供体细胞的羊培养传代体细胞去核移核电融合+_重构胚寄母克隆羊胚胎移植NEO克 隆 猴 的 技 术 路 线克隆鼠的制作过程M2M2期卵母细胞的收集期卵母细胞的收集Enucleate（去核）（去核）细胞质内直接注射法细胞核移植培养的山羊体细胞A:培养三天后的颗粒细胞培养三天后的颗粒细胞 B:培养十天后的颗粒细培养十天后的颗粒细胞胞 C:传代细胞的卵巢颗粒细胞传代细胞的卵巢颗粒细胞 D:成纤维细胞成纤维细胞ABDC重构卵经琼脂包埋，体内培养6天后回收到发育的成桑椹胚或囊胚的重构胚，左为桑椹胚，右上方为囊胚克隆亲子鉴定u采用DNA指纹
17、法u采用PCR/RFLP克隆羊的克隆羊的DNA 指纹图谱鉴定指纹图谱鉴定 A：提供体细胞的：提供体细胞的 基因羊基因羊 B：寄母羊寄母羊C：正常：正常母羊母羊 D：克隆羊，第一只克隆羊，第一只（2019.10.12019.10.1出生）出生）E:克隆羊，第二只克隆羊，第二只（2019.10.12019.10.1出生）出生）A B C D EM:marker1:1:基因羊基因羊9:9:克隆羊，第一只克隆羊，第一只10:10:克隆羊，第二只克隆羊，第二只8:8:寄母羊寄母羊7:7:正常羊正常羊4:4:正常羊正常羊5:5:正常羊正常羊A:A:正常羊正常羊B:B:正常羊正常羊3、克隆动物的应用前景n用
18、于拯救濒危野生动物用于拯救濒危野生动物n用于医学治疗（克隆性治疗）用于医学治疗（克隆性治疗）n复制和制备转基因动物复制和制备转基因动物n大量扩增优良品质的家畜大量扩增优良品质的家畜n发育生物学基因研究发育生物学基因研究人体细胞克隆应用于疾病治疗的模式四、性别控制与胚胎性别鉴定n1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论，1966年Jacobs等又发现雄性决定因子位于Y染色体的短臂上。n1989年，Palmer等在Y染色体的短臂上找到了性别决定区（SRY），并得出不同动物间有很强的同源性。nSRY序列的发现是二十世纪生命科学的重大成果之一，为人类最终完成哺乳动物性别控制
19、这一历史性任务奠定了理论基础。性别控制技术-示意图性别控制技术1 1X X、Y Y精子的分离：精子的分离：当前最有效的方法是当前最有效的方法是借助流式细胞分离仪。它借助流式细胞分离仪。它根据根据X X、Y Y精子精子DNADNA含量的含量的差异，借助特异性染色剂差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧染色，然后根据发出的荧光强度测定光强度测定DNADNA含量，来含量，来分离分离X X、Y Y精子。精子。性别控制技术 2 2胚胎的早期性别鉴定：胚胎的早期性别鉴定：SRYPCRSRYPCR鉴定法：是利用鉴定法：是利用Y Y染色体上的雄性特异染色体上的雄性特异性片段，通过性片段，通过PCRPCR
20、扩增少量胚胎细胞的特异性基因片扩增少量胚胎细胞的特异性基因片段，确定胚胎性别。该法每次测定只需段，确定胚胎性别。该法每次测定只需5858个胚胎个胚胎细胞，准确率达细胞，准确率达95%95%；一般取样后的胚胎鲜胚移植对；一般取样后的胚胎鲜胚移植对妊娠无影响，而冻胚的妊娠率下降妊娠无影响，而冻胚的妊娠率下降5-10%5-10%。早期性别鉴定技术路线性别鉴定 3 3简便、快速、准确的简便、快速、准确的基因扩增方法：其特点是基因扩增方法：其特点是对目标基因的对目标基因的6 6个区段设定个区段设定4 4种引物，利用链置换反应种引物，利用链置换反应在等温条件下使其发生反在等温条件下使其发生反应。同时，由于
21、采用了扩应。同时，由于采用了扩增雄性特异性以及雌雄共增雄性特异性以及雌雄共有的核酸序列引物，检出有的核酸序列引物，检出的正确率高，该方法即将的正确率高，该方法即将应用于奶牛胚胎的性别鉴应用于奶牛胚胎的性别鉴定。定。第二节 分子遗传标记的应用一、基本概念一、基本概念uantitative uantitative rait rait ocus(Loci)=ocus(Loci)=数量数量性状基因座性状基因座=对数量性状产生影响的对数量性状产生影响的 或或（染色体片段）（染色体片段）=利用（分子）遗传标记，通过标记利用（分子）遗传标记，通过标记-QTL-QTL连锁连锁分析（基因组扫描）被检测出并被定位
22、的分析（基因组扫描）被检测出并被定位的QTLQTL=有较大效应且可以直接测定其基因型的有较大效应且可以直接测定其基因型的QTLQTLarker-ssisted election=标记辅助标记辅助选择选择=借助（分子）遗传标记信息选择种用个体借助（分子）遗传标记信息选择种用个体（个体遗传评定）（个体遗传评定）在猪上已被发现的标记在猪上已被发现的标记QTLu生长速度和背膘生长速度和背膘=第第4 4、6 6、7 7、1313染色体染色体u肉质肉质=第第4 4、7 7染色体染色体u产仔数产仔数=第第8 8染色体染色体u抗病性状抗病性状=第第6 6、7 7染色体染色体(Rothschild,2019)在
23、猪上已发现的主效基因在猪上已发现的主效基因(Rothschild,2019)二、二、MASn1、MAS的优越性的优越性n增加遗传评定的准确性增加遗传评定的准确性n进行早期遗传评定进行早期遗传评定n减少遗传评定的成本减少遗传评定的成本n获得更大的遗传进展和育种效益获得更大的遗传进展和育种效益2 2、影响、影响MAS相对效率的主要因相对效率的主要因素素vQTLQTL效应大小效应大小vQTLQTL与标记及标记与标记间的连锁程度与标记及标记与标记间的连锁程度vMASMAS的应用策略的应用策略v选择的世代数选择的世代数v性状的性质性状的性质=遗传力遗传力=是否限性是否限性=测定的难易程度测定的难易程度=
24、是否连续分布是否连续分布3、MAS应用中的潜在问题应用中的潜在问题v测定标记基因型及分析测定标记基因型及分析QTLQTL的成本的成本现阶段仍然是应用现阶段仍然是应用MASMAS的主要障碍之一的主要障碍之一随着新的测定技术（如随着新的测定技术（如PCRPCR、DNADNA芯片）和分芯片）和分析方法的不断出现，这个障碍将被克服析方法的不断出现，这个障碍将被克服v检测检测QTLQTL与实施与实施MASMAS的时间差的时间差远交群体中检测远交群体中检测QTLQTL通常需要通常需要2323代的资料代的资料在实施在实施MASMAS的群体中的群体中QTLQTL的等位基因频率可能的等位基因频率可能已经发生变化已经发生变化
