1、目的基因目的基因 载体载体体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路基因克隆的技术路线线大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系优越性优越性：1.1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；的分子机理有深刻的了解；2.2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；用的寄主菌株和不同类型的载体；3.3.许多克隆的真核基因都可以在
2、大肠杆菌细胞中许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；实现有效、高水平的表达；4.4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。用于批量生产。大肠杆菌中表达体系的大肠杆菌中表达体系的不足不足：1.1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。大的差别。2.2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷可能
3、含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。酸序列。3.3.真核基因真核基因mRNAmRNA的分子结构同细菌的有所差异，的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因影响真核基因mRNAmRNA稳定性。稳定性。4.4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装），转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；并不存在；5.5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
4、大肠杆菌表达载体启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止子转录终止子3.2 3.2 有功能的启动子的分离有功能的启动子的分离 报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子用pK01筛选启动子用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子使用四环素（使用四环素（TetTetr
5、r）作报告基因分离功能启动子）作报告基因分离功能启动子用pK01筛选启动子使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。来源于pBR322检测启动子强弱的原理：检测启动子强弱的原理：半乳糖激酶能够从半乳糖激酶能够从ATPATP分分 子上转移一个磷酸集团子上转移一个磷酸集团 给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖化作用，形成半乳糖-1-1-磷酸。磷酸。用同位素标记用同位素标记ATPATP，测定从，测定从ATPATP转移到半乳转移到半乳糖去的糖去的3232P P的放射性强度，可推算报告基因的放射
6、性强度，可推算报告基因（galKgalK）表达的半乳糖激酶的产量。）表达的半乳糖激酶的产量。分离功能的启动子分离功能的启动子 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1pOK1质粒质粒载体的单克隆位点上；载体的单克隆位点上；将将DNADNA重组分子，转化给宿主细胞（重组分子，转化给宿主细胞（GalEGalE、GalTGalT、GalKGalK），避免内源半乳糖激酶的干扰；），避免内源半乳糖激酶的干扰；将它们涂布在麦氏培养基将它们涂布在麦氏培养基（含有（含有PHPH值指示剂的中值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化上
7、，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。子（重组子产生红色的菌落）。大肠杆菌的大肠杆菌的LacLac启动子启动子大肠杆菌的大肠杆菌的trptrp启动子启动子TacTac启动子启动子LacLac启动子启动子trptrp启动子启动子 融合型表达载体：融合型表达载体：-融合蛋白融合蛋白 非融合型表达载体：非融合型表达载体：-天然完整蛋白天然完整蛋白 分泌型表达载体：分泌型表达载体：-产物可跨膜分产物可跨膜分 泌至胞周间隙泌至胞周间隙1 1、选择合适载体，提高翻译水平、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平提高转录水平 核糖体结合位点（核糖体结合位点（ATG-SDATG-SD）避免产
8、物降解避免产物降解 ：分泌：分泌/融合表达融合表达 细菌蛋白酶抑制剂细菌蛋白酶抑制剂2 2、选择合适宿主、选择合适宿主 Lac Lac 启动子启动子-LacI-LacI菌菌 P PL L启动子启动子-cI857 cI857 溶源菌溶源菌 3 3、诱导表达、诱导表达 温度诱导温度诱导-P-PL L IPTGIPTG的化学诱导的化学诱导-Plac-Plac、Ptac Ptac 4 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因非融合型蛋白表达非融合型蛋白表达融合型蛋白表达融合型蛋白表达
9、PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因融合蛋白质的纯化的基本原理：融合蛋白质的纯化的基本原理：利用与融合蛋白质配偶体相对应的利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。纯化的融合蛋白质。融合蛋白质中目的蛋白的纯化 1.1.溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr）切割法：）切割法：能特异性的从甲硫
10、氨酸残基处切割多肽链。如能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。如 胰岛素的制备。胰岛素的制备。2.2.胰蛋白酶切割法：胰蛋白酶切割法：能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异 性的切割。性的切割。3.3.凝血因子凝血因子XaXa切割法：切割法：能唯一地从特异识别序列能唯一地从特异识别序列C C末端切割多肽末端切割多肽外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位:1.1.细胞质中表达细胞质中表达 2.2.周质中表达周质中表达 3.3.胞外表达胞外表达1、细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特
11、殊的生理现象，形成包含体。常会发生一种特殊的生理现象，形成包含体。包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分酸残基组分优点：1.1.形成包含体形成包含体 a.a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b.b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c.c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞 受伤
12、害受伤害2.2.蛋白质的产量高蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。质在大肠杆菌中超量表达。3.3.表达的质粒载体构建比较简单。表达的质粒载体构建比较简单。缺点：1.1.包含体包含体 a.a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法 恢复其生物学活性恢复其生物学活性 b.b.蛋白质的终产量偏低蛋白质的终产量偏低 c.c.蛋白质的生产成本比较昂贵蛋白质的生产成本比较昂贵2.2.还原的环境不利于二硫键的形成还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋
13、白系统、谷氧还蛋白系统）（硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）3.3.蛋白质会被酶解蛋白质会被酶解 4.4.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 2、周质中表达 周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌 中，位于内膜和外膜之间的细胞中，位于内膜和外膜之间的细胞 结构部分。结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。质。优点：优点：1.1.由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标 蛋白质的纯化就比较简单蛋白质的纯化就
14、比较简单 2.2.蛋白质酶解的程度不甚严重蛋白质酶解的程度不甚严重 3.3.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）（氧化环境）在正确折叠的蛋白质，在转运过程在正确折叠的蛋白质，在转运过程 中，在体内对信号肽进行切割中，在体内对信号肽进行切割缺点：缺点：1.1.信号肽并非总是有助于蛋白质的信号肽并非总是有助于蛋白质的 转运转运 2.2.有可能形成包含体有可能形成包含体3、胞外表达 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。离纯化。途径：途径：1.1.用大肠
15、杆菌细胞固有的途径，使真正属于分用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分 泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）（不是特别有效的程序）2.2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）（可以分离到中等产量的蛋白质）优点：优点：1.1.蛋白质的酶解作用程度低蛋白质的酶解作用程度低 2.2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化因此目标蛋白容易纯化 3.3.增进了蛋白质的折叠作用增进了蛋白质的折叠作用 缺点：缺点：1.1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真在大肠杆菌细胞中表达的外源真 核蛋白质，通常是不会分泌到胞核蛋白质，通常是不会分泌到胞 外培养基中去的外培养基中去的 2.2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白由于分泌在胞外培养基中的蛋白 质相当稀释，因此目标蛋白质的质相当稀释，因此目标蛋白质的 纯化过程比较复杂纯化过程比较复杂3.4 原核生物表达产物的分离纯化复性中常采用的方法：稀释复性稀释复性谢谢大家！谢谢大家！
