1、参考书目参考书目1 1 实用生物组织学技术实用生物组织学技术 刘世新刘世新 科学出版社科学出版社2 2 组织病理技术组织病理技术 李甘地李甘地 人民卫生出版社人民卫生出版社Z形态学的研究方法包括形态学的研究方法包括生活观察生活观察( (组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养) )死后观察死后观察( (大体解剖技术、组织学技术、电镜技术、免大体解剖技术、组织学技术、电镜技术、免疫组织化学技术和细胞凋亡检测疫组织化学技术和细胞凋亡检测) )Z 有利于课题设计和研究工作的开展有利于课题设计和研究工作的开展Z方法简单，实验过程成熟，实验仪器简单。方法简单，实验过程成熟，实验仪器简单。前言前言1 12 2
2、 方法方法1 12 21 1 标本收集标本收集 胎盘娩出后，立即从母体面随机选取胎盘娩出后，立即从母体面随机选取2 2块大块大小约为小约为3cm x 2cm xlcm3cm x 2cm xlcm的组织的组织( (避开钙化灶避开钙化灶) )生理盐水冲洗后，生理盐水冲洗后，每块标本切取约每块标本切取约1cm xlcm xlcm1cm xlcm xlcm的组织，的组织，40g/LPBS40g/LPBS甲醛溶液固甲醛溶液固定用于电镜检查的组织放入定用于电镜检查的组织放入25g/L25g/L的戊二醛液中固定其余部分的戊二醛液中固定其余部分立即置入立即置入7070冻存前者常规石蜡包埋，冻存前者常规石蜡包埋
3、，4um4um连续切片备染连续切片备染1 12 22 2 光镜、电镜检查光镜、电镜检查 所有的标本均行光镜检查切片用苏所有的标本均行光镜检查切片用苏木精木精伊红染色，分别由两人观察，每张切片观察伊红染色，分别由两人观察，每张切片观察1010个高倍视野，个高倍视野，蜕膜组织细胞不计数在内使用透射电镜各检查蜕膜组织细胞不计数在内使用透射电镜各检查4 4例例SPIHSPIH及正常胎及正常胎盘组织所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织盘组织所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织块块1 12 23 3 免疫组化免疫组化 切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加 HSP
4、70HSP70及及baxbax抗体抗体4 4 过夜；过夜；DAKOEnvisionnDAKOEnvisionn加入后温育加入后温育1h1h，DABDAB显色苏显色苏木精复染，脱水封片光镜观察阳性结果为细胞内有棕黄色颗木精复染，脱水封片光镜观察阳性结果为细胞内有棕黄色颗粒出现，依显色程度分粒出现，依显色程度分3 3级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性色为强阳性 免疫组织化学免疫组织化学？ ？主要内容主要内容石蜡切片技术石蜡切片技术免疫组化技术免疫组化技术 图像采集与分析图像采集与分析实验动物实验动物一一 实验动物实验动物1 动物处死动物处死1 1、空
5、气栓塞致死法、空气栓塞致死法: :取取50-100ml50-100ml注射器注射器, ,从兔的耳静脉从兔的耳静脉或大动物的腹股沟的股静脉迅速注入或大动物的腹股沟的股静脉迅速注入. .兔和猫的致死空兔和猫的致死空气量为气量为20-40ml.20-40ml.此方法迅速、方便，但各脏器淤血明此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。显。 2 2、脑、脊髓破坏法：用金属探针经枕骨大孔入，蛙类、脑、脊髓破坏法：用金属探针经枕骨大孔入，蛙类3 3、断椎发：大白鼠和小白鼠、断椎发：大白鼠和小白鼠4 4 、麻醉后处死法：试剂：乙醚或氯仿、麻醉后处死法：试剂：乙醚或氯仿5-20ml5-20ml吸入麻醉法：适用于小白鼠
6、、大白鼠、豚鼠及兔吸入麻醉法：适用于小白鼠、大白鼠、豚鼠及兔 注射麻醉法：适用于狗、猴等较大动物。注射麻醉法：适用于狗、猴等较大动物。 5 5、急性大失血处死法：、急性大失血处死法：（1 1）眼球摘除放血：适用于小白鼠、大白鼠）眼球摘除放血：适用于小白鼠、大白鼠（2 2）血管切开放血：狗、猴及兔）血管切开放血：狗、猴及兔 取材方法取材方法 (3)(3)取材时严禁机械损伤，取材时严禁机械损伤， (4)(4)尽量注意脏器的完整性尽量注意脏器的完整性; ; 管状或囊状组织不应管状或囊状组织不应斜切：剪开铺在硬纸板上，黏膜面朝上斜切：剪开铺在硬纸板上，黏膜面朝上(1)(1)取材的先后：消化管，肝脏、脾
7、脏等多血器官及神取材的先后：消化管，肝脏、脾脏等多血器官及神经组织，其他脏器。经组织，其他脏器。(2)(2)取材的大小：一般取材的大小：一般2cm2cm1.5cm1.5cm0.3cm,0.3cm,较小的组织较小的组织如淋巴结、脑垂体应整个固定。如淋巴结、脑垂体应整个固定。脑组织较柔软，最好用纱布包裹后在固定，脑组织较柔软，最好用纱布包裹后在固定，标本固定标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。(1)(1)常用的固定液：常用的固定液： (3)
8、Bouin(3)Bouin液液甲醛：甲醛：10ml10ml苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液(0.9)(0.9)75ml75ml蒸馏水：蒸馏水：90ml 90ml 甲醛甲醛 25ml 25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml5ml(2)(2)中性缓冲甲醛固定液：中性缓冲甲醛固定液： 多聚甲醛：多聚甲醛： g g蒸馏水：蒸馏水： 100ml100mlNaHNaH2 2POPO4 4.H.H2 2O: 4gO: 4gNaNa2 2HPOHPO4:4: 6.5g 6.5g标本固定标本固定目的：目的：防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细胞与生活时的形态相似。胞与生活时的形态相似。
9、物质定位在原有部位。物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。同亲和力，利于着色。固定剂还有硬化作用。固定剂还有硬化作用。对象：蛋白质对象：蛋白质 标本固定标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。(2)(2)中性缓冲甲醛固中性缓冲甲醛固定液：定液： 多聚甲醛：多聚甲醛： g g蒸馏水：蒸馏水： 100ml100mlNaHNaH2 2POPO4 4.H.H2 2O: 4gO:
10、4gNaNa2 2HPOHPO4:4: 6.5g 6.5g(1)(1)10%10%甲醛固定液：甲醛固定液：甲醛甲醛（市售含量为（市售含量为36-40%36-40%） 10ml10ml蒸馏水：蒸馏水：90ml90ml(3)Bouin(3)Bouin液液苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液(0.9%-(0.9%-1.2%) 1.2%) 75ml75ml甲醛甲醛 25ml25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml5ml固定注意事项固定注意事项 固定时间要快固定时间要快 固定液的用量为组织块体积的固定液的用量为组织块体积的15-2015-20倍倍 固定时间固定时间1 1 固定液避光，以免发生化学变化固定液避光，以免发
11、生化学变化二二 石蜡切片石蜡切片每次更换新的脱水剂，每次更换新的脱水剂，把组织放到吸水纸上吸把组织放到吸水纸上吸干，干，装组织的容器，装组织的容器，也要控感水分，也要控感水分，呦呦二二 石蜡切片石蜡切片光线基本光线基本能透过组能透过组织，组织织，组织呈透明或呈透明或半透明立半透明立即取出，即取出，避免时间避免时间过长过长咋算咋算透明透明达到达到效果，效果，啊？啊？二二 石蜡切片石蜡切片二二 石蜡切片石蜡切片切片中容易切片中容易出现的问题出现的问题 解决办法？解决办法？染色染色 H EH E染色染色 镀银染色镀银染色 应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显示组织
12、和细胞的一些特殊结构。镀银染色染示组织和细胞的一些特殊结构。镀银染色染色是组织学常用的一种方法，可用来显示神色是组织学常用的一种方法，可用来显示神经元纤维、突触、神经末梢、网状纤维等。经元纤维、突触、神经末梢、网状纤维等。 兔肝兔肝 PASPAS染色染色 猫气管猫气管 阿利新蓝染色阿利新蓝染色 碳水化合物组织化学染色碳水化合物组织化学染色 脂类组织化学染色脂类组织化学染色用苏丹红染兔皮下脂肪组织内的脂滴呈鲜红色免疫电镜技术免疫电镜技术亲和免疫组织化学技术亲和免疫组织化学技术免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术内 容将已知的抗原或抗体标记上荧光素将已知的抗原或抗体标记上荧光素, ,荧光素受激发光
13、的照荧光素受激发光的照射，由低能状态进入射，由低能状态进入 高能状态，电子越迁后，辐射光量高能状态，电子越迁后，辐射光量子释放能量回到原来的低能态。这时发出明亮的荧光。子释放能量回到原来的低能态。这时发出明亮的荧光。被荧光显微镜扑捉，从而对抗原进行定位、定量。被荧光显微镜扑捉，从而对抗原进行定位、定量。一一 原理原理二二 实验方法实验方法 1 1直接法直接法荧光标记已知特异性抗体荧光标记已知特异性抗体( (抗原抗原) )直接用于细胞或组织抗原直接用于细胞或组织抗原( (抗体抗体) )的检测的检测二二 实验方法实验方法间接法间接法 二二抗抗二二 实验方法实验方法编号编号 品种品种 价格价格BA1
14、101 BA1101 羊抗小鼠羊抗小鼠IgGFITC 140IgGFITC 140元元/0.1ml/0.1mlBA1108 BA1108 兔抗大鼠兔抗大鼠IgGFITC 160IgGFITC 160元元/0.1ml/0.1ml二二抗抗二二 实验方法实验方法3 3 双重免疫荧光组织化学标记方法双重免疫荧光组织化学标记方法在同一组织标本上同时检查两种抗原,APAP APAP采用戊二醛标记在抗体上采用戊二醛标记在抗体上, ,可以用于可以用于Western BlottingWestern Blotting免疫细免疫细胞化学胞化学ELISAELISAABC复合物ABCABC复合物复合物材料材料: :冰冻
15、切片或石蜡切片材料冰冻切片或石蜡切片材料: :冰冻切片或石蜡切片冰冻切片或石蜡切片阻断内源性酶阻断内源性酶 阻断内源性酶阻断内源性酶10%10%正常羊血清正常羊血清, ,室温室温15min 15min 10%10%正常羊血清正常羊血清, ,室温室温15min15min适当稀释的一抗适当稀释的一抗, ,室温室温30min 30min 适当稀释的一抗适当稀释的一抗, ,室温室温30min30minPBSPBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min 5min PBSPBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min5min 加生物素标记的二抗加生物素标记的二抗,30min ,30min 加加25-50ug/m
16、l25-50ug/ml生物素标记的二抗生物素标记的二抗,60min,60minPBSPBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min PBS5min PBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min5min 加加ABCABC复合物复合物, ,室温室温30min 30min 加加25-50ug/mlHRP25-50ug/mlHRP标记的亲合素标记的亲合素,60min,60minPBSPBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min PBS5min PBS洗洗3 3次次, ,每次每次5min5min加底物显色加底物显色, ,封片封片. . 加底物显色加底物显色, ,封片封片悬浮态抗原抗原复合物负染色悬浮态抗原细胞内
17、、外抗原 固定、切片染色等处理 予被标记抗体可以是与被检测的抗原相应特异予被标记抗体可以是与被检测的抗原相应特异性抗体（一抗），亦可为二抗。但抗体本身没有内性抗体（一抗），亦可为二抗。但抗体本身没有内在电子致密性，不宜用电镜观察，因此需要使抗体在电子致密性，不宜用电镜观察，因此需要使抗体与电子致密的标记物结合形成特殊的标记抗体。与电子致密的标记物结合形成特殊的标记抗体。常用的抗体标记方法有三种：常用的抗体标记方法有三种： 1.铁蛋白标记抗体2.酶标记抗体3.胶体金标记抗体A.铁蛋白标记抗体制备铁蛋白标记抗体制备铁蛋白铁蛋白:是一种含Fe2+的蛋白质，内含直径5560nm的铁胶粒核心，有2000
18、3000个铁原子，这些铁原子使之成为电子致密物。双功能试剂双功能试剂:（如戊二醛等）分子量低，能同时与铁蛋白和抗体结合。铁蛋白标记抗体铁蛋白标记抗体:将铁蛋白、双功能试剂、欲标记抗体混合即得之。B.反应机制：反应机制：CC特点特点研究悬浮液、细胞表面、细胞内的抗研究悬浮液、细胞表面、细胞内的抗原的定性或定位，如：病毒、细菌、红原的定性或定位，如：病毒、细菌、红血球、腹水癌细胞和淋巴细胞等抗原的血球、腹水癌细胞和淋巴细胞等抗原的定位等，定位等，用于病理学中研究抗体的形成及其在用于病理学中研究抗体的形成及其在细胞内的定位等。细胞内的定位等。A.酶标记抗体制备酶标记抗体制备酶酶（常用辣根过氧化物酶）
19、（碱性磷酸酶适于标记植物细胞的抗体）。与抗体交联后仍能保持活性抗体抗体（一抗或二抗）底物底物在酶的作用下形成致密物，可用电镜检测；B.反应机制：反应机制：酶复合物与抗原作用，形成免疫复合物，再与适宜的底物作用，生成电子致密的反应产物。优点：酶分子量较铁蛋白小，更适合细胞内抗原定位研究。染色强度随反应时间增长而增强。缺点：反应产物易堆积、扩散使分辨率降低。动、植物体内的组织和细胞中含有大量的抑制性内源酶，往往会产生各种非特异性的反应。A.胶体金标记抗体制备胶体金标记抗体制备胶体金胶体金是一种由极小的金颗粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。胶体金与抗体先结合，再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反
20、应，形成抗原与胶体金标记的抗体复合物。B反应机制：反应机制：C.特点：特点：胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、电子密度高、便于观察和分析。选择直径规格不同可对同一细胞中的不同种抗原进行双重或三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。因为胶体金颗粒的直径小，容易渗透到细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能进行半定量的研究。 细胞内抗原的定位法：细胞内抗原的定位法： （1）前固定：）前固定：12的戊二醛轻微固定。 （2）打开细胞膜：）打开细胞膜：铁蛋白的分子量较大，为了使其能渗透到细胞内进行标记，免疫反应前先使细胞膜打开。（冻融法、冷冻切片、药物
21、处理） （3）免疫反应：）免疫反应： 直接免疫反应：直接免疫反应：把样品浸入免疫铁蛋白溶液中，37 C 40 60分钟。然后用缓冲液彻底清洗。 间接免疫反应：间接免疫反应：把样品浸入无标记的特异性抗体中，室温下作用2030分钟。用缓冲液充分洗去没结合上的抗体之后，再与免疫铁蛋白作用。 （4）固定、脱水和包埋、切片）固定、脱水和包埋、切片。细胞表面抗原的定位法：细胞表面抗原的定位法： （1）12戊二醛固定样品戊二醛固定样品115分钟。分钟。 （2）把样品浸在铁蛋白标记物中）把样品浸在铁蛋白标记物中1时，时， （3）用戊二醛缓冲液固定）用戊二醛缓冲液固定13小时。小时。 （4）常规脱水、包埋和超薄
22、切片。）常规脱水、包埋和超薄切片。病毒和生物大分子等病毒和生物大分子等 （1）铜网膜上加一滴牛血清蛋白略干，）铜网膜上加一滴牛血清蛋白略干， （2）将样品悬液滴其上，滤纸吸干，）将样品悬液滴其上，滤纸吸干， （3）滴一大滴铁蛋白）滴一大滴铁蛋白抗体复合物，反应抗体复合物，反应5min （4）缓冲溶液漂洗。）缓冲溶液漂洗。 （5）甲酸铀负染。）甲酸铀负染。 病毒感染的细胞：病毒感染的细胞： （1）前固定：多聚甲醛固定）前固定：多聚甲醛固定 2 3小时，彻底清小时，彻底清洗。洗。 （2）加酶标记抗体：放在）加酶标记抗体：放在37C恒温水浴中作用恒温水浴中作用45分钟，再转入分钟，再转入 4C冰箱中
23、作用冰箱中作用 6 12小时，清洗。小时，清洗。 （3）中间固定：）中间固定：25戊二醛缓冲液，戊二醛缓冲液，4C下，下，1小时，清洗。小时，清洗。 （4）加底物：）加底物： 在在 37C下孵育下孵育 30分钟。分钟。 （5）后固定：）后固定：1俄酸，俄酸，4 C， 30 60分钟，清分钟，清洗。洗。 （6）脱水、常规包埋、超薄切片。）脱水、常规包埋、超薄切片。细胞表面（或细胞外）抗原细胞表面（或细胞外）抗原 (1）前固定：用）前固定：用 戊二醛固定戊二醛固定 115分钟，分钟，清洗。清洗。 （2）免疫酶染色：在）免疫酶染色：在 2037 C下，染下，染 3060分钟，清洗。分钟，清洗。 （3
24、）中间固定：用）中间固定：用3戊二醛固定戊二醛固定13小小时。时。 （4）加底物：）加底物： （5）后固定：）后固定：l俄酸俄酸1030分钟，分钟，4。 （6）常规脱水、包埋、超薄切片。）常规脱水、包埋、超薄切片。 细胞内抗原的染色细胞内抗原的染色： （1）固定：）固定： （2）脱水、包埋和制作超薄切片：）脱水、包埋和制作超薄切片： （3）溶去包埋介质、彻底清洗。）溶去包埋介质、彻底清洗。 （4）免疫反应：把载网漂浮在酶标记的抗）免疫反应：把载网漂浮在酶标记的抗体溶液上，室温下作用体溶液上，室温下作用30分钟，清洗。分钟，清洗。 （5）加底物：）加底物： （6）饿化：）饿化：1饿酸处理饿酸处理
25、1015分钟。分钟。 免疫胶体金标记悬浮样品的抗原： （1）沾样：）沾样：取一滴悬浮样品点滴在蜡盘上，把已有支持膜的载网膜面朝下放在液滴上，室温下作用57分钟。清洗. （2）封闭：）封闭：取一滴1BSA，把切片的膜面朝下放在液滴上，37C下作用30分钟（用以除去非特异的染色）。清洗 （3）一抗处理：）一抗处理：把载网膜面朝下漂浮在单克隆抗体的液滴上37C下30分钟。清洗 （4）桥接：把载网膜面朝下漂浮在免抗鼠IgG液滴上，37C3 0分钟。清洗 （5）二抗处理：）二抗处理：把载网放在羊抗兔IgG胶体金的液滴上清洗 （6）自然干燥后电镜观察。）自然干燥后电镜观察。 1.研究组织细胞的形态功能，细菌、病毒等病原物的形态结构和性质。2.在研究细胞表面和细胞内某种抗原的定位和定性。3.抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况。4.抗原一抗体复合物的精细结构，以及鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化。 总之，这一技术把细胞超微结构及其功能的研究结合起来，在病理学、生理学、免疫学等学科的研究中研究中得到了广泛的应用。
