1、a1Y染色体微缺失检测染色体微缺失检测迪安医学检验中心迪安医学检验中心a2一、背景 1 全球不育夫妇占已婚夫妇10%-15% 2 其中男性原因占40%-50% 3 遗传因素占男性不育的30% 4 10%15%的特发性无精症存在 Y 染色 体的微缺失a3二 Y染色体微缺失相关基因Y染色体是最短的近端着丝粒染色体 ,是男性特有的染色体。1976年，Tiepolo和Zuifaidi首先提出Y染色体上有多个基因参与生精过程。多年研究，发现男性特有的Y染色体上面存在一个关键的与生育相关的因子的区域，称为AZF区。目前认为在AZF区上存在四个精子发生亚区（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd），各亚区包
2、含的位点在男性生殖细胞发育的不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育。 一般认为，Y染色体的近端缺失（涉及AZFa和AZFb），表现以唯支持细胞综合症为主的严重生精障碍，Y染色体的远端缺失（涉及AZFd和AZFc），可残留岛状的生精正常区域。对无精症患者中，对检查睾丸过小或睾丸活检仍无精子患者，一般不再行AZF基因检测。总之，开展染色体和AZF检测，可全面评价男性不育遗传缺陷，从而更好的解释发病原因，提供遗传咨询和指导临床诊疗。 1996年将 AZF区划分为 3个区:AZFa、AZFb、 AZFc。1999 年研究发现在 AZFb 和 AZFc 间存在AZ
3、Fd。研究发现 ,在 Y染色体 AZFa、 AZFb、 AZFc3个区至少发现 15个与精子发生相关的基因，AZFd区尚未发现相关基因。a4二 Y染色体微缺失相关基因 AZFa缺失的病人 , 主要表现为唯支持细胞综合征伴睾丸体积缩小 ,无精子生成 AZFb缺失的病人主要表现为生精过程阻滞在精母细胞阶段 ,无精子生成 AZFc区缺失病人表现多样化 ,会出现无精子症和少精子症的不同临床表现a5二 Y染色体微缺失相关基因AZFa缺失患者 33%为严重少精子,67%表现为无精子AZFb缺失患者 9%轻度少精子, 23%严重少精子 , 68%无精子AZFc缺失患者 46%严重少精子 , 54%无精子a6
4、二 Y染色体微缺失相关基因AZFa - b缺失患者 50%严重少精子50%无精子AZFa - c缺失患者 100%无精子AZFb - c缺失患者 4%严重少精子 , 96%无精子a7二 Y染色体微缺失相关基因 AZFa缺失较为少见 ,占整个 AZF缺失 4 .9%。整个 AZFa区域缺失通常表现为 SCOS,为绝对的无精子症。若患者为 AZFa缺失 ,不建议做睾丸穿刺寻找精子进行卵细胞胞质内单精子注射，目前只能寻求供精人工授精技术来获得妊娠。a8二 Y染色体微缺失相关基因 AZFb缺失也不多见 ,占整个 AZF缺失 15 .8%。缺失的典型睾丸组织学特征是精子成熟障碍,主要停滞在初级精母细胞阶
5、段。但也有 SCOS的报告，睾丸穿刺不能获得精子 ,因此 ,临床上也不建议做睾丸穿刺。a9二 Y染色体微缺失相关基因 AZFc缺失是临床上最常见的 AZF缺失类型 ,临床和睾丸组织学表型多种多样。一般说来 ,AZFc缺失患者尚存精子生成能力。AZFc缺失见于无精子症或严重少精子症患者 ,罕见情况下 ,也可以在自然状态下遗传给其男性后代 在无精子症患者中,AZFc缺失者通过睾丸精子穿刺获得精子的机会比其他缺失类型大 ,同时可以从睾丸穿刺获得精子进行 I CSI受孕 ,但这些患者的男性后代都将是 AZFc缺失的携带者，建议在进行试管婴儿前 ,行遗传咨询。a10三 AZF微缺失与其他不育因素AZF微
6、缺失与隐睾症AZF微缺失与精索静脉曲张AZF微缺失与双侧输精管缺如AZF微缺失与睾丸支持细胞AZF微缺失与生殖激素异常AZF微缺失与其他不育因素a11四 染色体微缺失的检测方法 核型分析总体上来说操作繁琐、效率不高, 尤其是难以检测出微小的染色体异常或变异。荧光原位杂交(Fluorescence isitu hybridization, FISH)虽然有更高的分辨率, 但其检测的范围为 20 kb5 Mb,对于微小的染色体缺失也难以检测, 且繁琐的实验操作与高昂的成本也限制了 FISH 技术在临床中的广泛应用。 a12四 染色体微缺失的检测方法目前关于 染色体微缺失的检测方法最常用的是多重聚合
7、酶链反应 () 技术 而检测的位点有很多 但有研究表明 - 和 这 个基因标志物能覆盖大部分已发现的微缺失 其他的位点序列灵敏度比较低, 当然不同种族间可能会有轻微的差异a13四 染色体微缺失的检测方法 由于不 同实验室采用 P C R方法不 同,导致实验结果各异。为提高诊断质量， 欧洲男科协 会( E A A ) 和欧洲分子遗传实验质控网( E MQ N) 在 1 9 9 9 、 2 0 0 4年先后颁布了第 1版和第 2版 Y染色体 微缺失分子诊断指南， 规范了检测微缺失时的Y 染色体序列标签点( s e q u e n c e t a r g e t e d s i t e s ，S T
8、 S ) 与 所采用的内外对照方法。a14四 染色体微缺失的检测方法 选择位于 Y染色体短臂 ( Y p ) 的睾丸决定基因( S RY ) 和锌指蛋白基因( Z F X Z F Y ) 为对照。Z F X Z F Y既存在于 x染色体短臂， 也存在于 Y p ， 其与 S R Y一起构成2个 目前推荐使用 的参照基因。每个 A Z F区域至少设置2个 S T S位点 才能正确有效. 其推荐的 S T S为 A Z F a ： s Y 8 4， s Y 8 6：A Z F b： s Y 1 2 7， s Y 1 3 4； A Z F c ： s Y 2 5 4， s Y 2 5 5 。多重 P
9、 C R 实验 中的引物应包括 ： s Y 1 4 ( S R Y ) ， z FY， ， s Y 8 4， s Y 8 6 ， s Y 1 2 7 ， s Y 1 3 4 ， s Y 2 5 4 ， s Y 2 5 5 。a15五 染色体微缺失相关基因研究的意义1 用于原发性无精或少弱精症的遗传咨询。通过遗传病因诊断， 找到男性不育的遗传病因， 则可避免不必要的药物及手术治疗。 2 进行辅助生育之前对其进行遗传病因诊断，可尽量避免将不良基因传递给下一代3 辅助生育精子质量筛选4 为未来的基因治疗提供理论依据。a165染色体微缺失相关基因研究的意义为临床治疗各种男性不育提供分子或细胞水平的依据
10、， 染色体微缺失虽然不会影响身体健康和心理健康 ，但会导致后代出现同样的不育问题 对于不育夫妇 ，特别是无精子症和严重少精症的不育夫妇，虽然其可以通过 达到妊娠的目的 ，并且有正常的胚胎发育和足月妊娠， 但在接受 治疗之前有必要进行 染色体微缺失的检测以及移植前遗传诊断， 尽量选择女婴， 切断遗传途径。a17EGFR突变与非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗a18一 背景肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤 ,男性肺癌占各类恶性肿瘤发病率的首位 ,女性肺癌发病率仅次于乳腺癌占第 2位。尽管手术和化疗技术不断提高 ,但肺癌患者的预后仍然很差 , 5年生存率仍 20%。近年来随着分子生物学技术的提高
11、,产生了一些针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强 ,能特异性地杀伤肿瘤细胞。其中以表皮生长因子受体 ( epidermal growth factor receptor, EGFR)为靶点的分子靶向治疗 (molecular targeted therapy)在非小细胞肺癌的治疗中日渐突出。a19EGFR属于受体酪氨酸激酶 ( recep t or tyrosine kinases, RTKs) ,调控细胞的生长、 分化、 血管生成及凋亡抑制 ,其信号通路与恶性肿瘤的生长、 侵袭及转移关系密切。靶向药物称作酪氨酸激酶抑制剂 ( tyr osine kinases inhibit ors,
12、 TKIs) ,其中吉非替尼 (Gefitibib,商品名为 Iressa 易瑞沙)和埃罗替尼 ( Erlotinib,商品名为 Tarceva 特罗凯)治疗可以使肿瘤缩小。在 Gefitibib和 Erlotinib的临床试验和治疗中 ,仅有一部分 NSCLC人群对药物有反应a20发现几乎所有对 TKIs敏感的 NSCLC患者都存在EGFR基因的体细胞突变。因此 ,研究 NSCLC患者不同治疗反应性的机制、 以及从中筛选出最适治疗对象进行有针对性的治疗具有重要临床意义。a21EGFR基因突变与 TKIs治疗敏感性文献报道：肺癌细胞中 EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向药物奏效的一个必要前
13、提条件,研究结果显示,对 EGFR突变型 NSCLC, Gefitinib的有效率高达80%以上 ,而对野生型肿瘤则基本无效。这一研究随后被相继其它研究所证实。a22EGFR基因位于 7号染色体短臂 7p1214区,由 28个外显子组成。EGFR在许多肿瘤中过表达,与肿瘤的生长侵袭及转移密切相关。在肺癌中,EGFR突变多出现于外显子 1821区。最常见的突变包括 19区的缺失突变 ( deleti on)和 21区的点突变 (point mutati on) ,这两种突变约占所有 EGFR突变的 85%90%。a23 外显子 19区的碱基缺失主要是第 746752位密码子的缺失突变 ,导致 E
14、G2FR蛋白中氨基酸序列丢失 ,这一缺失改变了受体酪氨酸激酶 ATP结合槽 (ATP2 binding cleft)的角度 ,从而改变了细胞对 TKIs的敏感性。 外显子 21的点突变主要是第 858位密码子出现 TG转换 ,引起 EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(简称 L858R) ,此种结构改变也使细胞对 TKIs的敏感性发生变化a24 其他 EGFR突变比较少见 ,包括外显子 18区的点突变和外显子 20区的插入突变a25TKIs治疗耐受与 EGFR二次突变 并不是所有的 EGFR突变都会导致对 Gefitinib或 Erl otinib敏感性的增加,对 Gefitini
15、b或 Erl otinib最初有反应的患者可发生二次突变而出现 TKI治疗耐受。如 T790M,发生在 EGFR外显子 20区 ,编码的苏氨酸转变为甲硫氨酸;氨基酸的改变导致了ATP结合区结构改变 ,使得细胞对 TKIs的敏感性降低。T790M突变也可出现在未做治疗的患者中 ,因此 ,对于 EGFR不同突变的功能有必要进一步研究 ,以明确某个或某几个突变是筛选适合 TKIs治疗患者的最佳指标。a26EGFR基因扩增和 CA重复序列的多态性 表达 EGFR或存在 EGFR基因扩增的患者对 Erlotinib治疗反应好 ,并且生存率得到明显提高。 研究发现：EGFR的高拷贝数与对药物较好的反应率、
16、 疾病控制率和存活率相联系。 EGFR蛋白的高表达与好的治疗结果之间的关联度则次之。 同时 EGFR突变与较好的反应率和预后有关。a27 但进一步的统计分析表明只有高的 EGFR基因拷贝数对应较高的存活率。 因此说明 , EGFR基因扩增可作为筛选 TKIs治疗的指标之一。a28 研究发现 ,位于 EGFR内含子 1的 CA重复序列的多态性可影响 EGFR的蛋白表达 ,低重复 CA数患者 EGFR的 RNA和蛋白表达高于高重复 CA数的患者 ,体外实验也证实低重复 CA数细胞对 Gefitinib的敏感性较高。a29EGFR家族其他成员 HER2/HER3 HER2可与 EGFR结合形成异源二
17、聚体 ,引发受体自身磷酸化过程。有研究认为 , HER2 2基因拷贝数增加的肿瘤对 Gefitinib更敏感。但亦有研究发现 , F ISH (原位荧光杂交 )检测 HER2或 HER3阳性肿瘤与阴性肿瘤相比 ,两组患者的病程进展时间及平均存活时间均没有显著差异。但是在体外细胞株的实验中 ,不论有无 EGFR 突变存在,HER2和 (或 ) HER3高表达的细胞表现出对 Gefitinib较高的敏感性。a30K-RAS基因突变 K-RAS是 EGFR信号通路下游的基因。与 EGFR基因突变相反 , K-RAS突变常见于吸烟者和分化差的肿瘤。而且发生 K-RAS突变的 NSCLC并不同时出现 EGFR突变 ,这两种基因的突变是互相排斥的,提示 K-RAS突变可以作为肿瘤对 TKIs治疗不敏感的指标 ,这部分患者应采用其他方式的治疗。a31总结 综上所述,以 EGFR受体酪氨酸激酶为靶点抗肿瘤药物已经成为晚期肺癌治疗的一种新选择。由于 NSCLC中 EGFR基因突变与 TKIs治疗敏感性显著相关 ,临床上应根据 EGFR突变情况来选择用药。针对 TKIs不敏感的患者 ,需要发展可对抗 EGFR二次突变以及其他调控分子的新的靶向药物。
