1、第八章 临床自动生化分析仪器 automatic biochemistry analyzer2022-10-1HITACHI 7080 全自动生化分析仪全自动生化分析仪2022-10-1BS-200全自动生化分析仪全自动生化分析仪 2003年，我国第一台拥有自主知识产权的BS-300全自动生化分析仪在深圳研制成功并投入临床应用。2022-10-1日立日立7180型全自动生化分析仪型全自动生化分析仪2022-10-1 自动生化分析仪自动生化分析仪由电脑控制，将生化由电脑控制，将生化分析中的取样分析中的取样、加试剂、混匀、保温反应、加试剂、混匀、保温反应、检测检测、结果计算、可靠性判断、显示和打结
2、果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗等步骤组合在一起自动进行印、以及清洗等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。操作的分析仪器。自动生化分析仪的定义自动生化分析仪的定义2022-10-1 自动生化分析技术的优点自动生化分析技术的优点n提高了临床生化检验质量和速度；n减轻检验人员的劳动强度；n节约样品和试剂；n增加检验项目；n提高检测精密度，减少实验误差；n并且有利于临床检验标准化的实现。2022-10-1第一节第一节 自动生化分析仪的类型自动生化分析仪的类型n按其工作方式不同分为：按其工作方式不同分为：n连续流动式连续流动式(continuous streaming movementcon
3、tinuous streaming movementstyle)style)或管道式：已很少用或管道式：已很少用n离心式离心式(centrifugation style)centrifugation style)：已很少用：已很少用n分立式分立式(discretediscretestyle)style)：应用最广泛应用最广泛n干片式干片式(drying style)drying style)：急诊多用急诊多用2022-10-1一、连续流动式自动生化分析仪一、连续流动式自动生化分析仪n1957年，美国的Technicon公司根据Skeggs的设计方案制造了世界上第一台自动生化仪AutoAnaly
4、zer。它就是单通道连续流动式单通道连续流动式。连续流动式的自动生化分析仪从早期的单通道，只测定2个生化指标，到1977年发展成内置计算机控制的连续多通道生化自动分析仪，每小时可测定150个样本，每个样本可测 20个生化指标。2022-10-1（一）仪器结构（一）仪器结构n1.概念：在测定过程中各待测样品与试剂混合后的化学反应均在同一管道内流动的过程中完成的。n2.仪器主要构成部件：nA.样品盘:置放聚乙烯塑料杯(或试管)，用以置放待测样品和标准液。nB.比例泵:样品和各种试剂的用量以及管道气泡的多少均由比例泵决定。nC.混合器:一种由玻璃制成的螺旋管，将比重不同的液体充分混合。nD.透析器:
5、作用是去除反应管道中大、小分子干扰物。2022-10-1（二）工作原理（二）工作原理n在微机控制下，通过比例泵将标本和试剂注入到连续的管道系统中，在一定的温度下，在管道内完成混合、去除干扰物，保温，比色测定，信号放大，运算处理，最后将结果显示并打印出来。2022-10-1（三）仪器特点（三）仪器特点n在检测过程中，样品和样品之间需用空气进行隔离，或用空白试剂或者是缓冲液来隔离。n1.空气分段系统:该系统是在样品输送的同时，由空气管吸入气泡，气泡将由同样原理吸入并在试剂管道中连续流动的试剂分成均匀的节段，防止交叉污染。n2.试剂分段系统:用试剂空白或缓冲液来间隔每个样品的反应液。又可分为流动注射
6、系统和间隙式系统。n流动注射系统的样品用转动阀加注，试剂流动仍用比例泵驱动，不再加入空气。按此规律，样品依次连续地被检测。n间隙式的特点是每一次进样都必须在前一样品的分析过程结束后(包括清洗)才能开始，不能连续依次进样 2022-10-1n由于所需试剂量大，易产生交叉污染，结构复杂，故障不易排除，到20世纪80年代初，连续流动式仪器已开始被20世纪70年代发展起来的分立式和离心式仪器所代替。2022-10-1二、离心式自动生物化学分析仪二、离心式自动生物化学分析仪（一）仪器结构（一）仪器结构n离心式生物化学分析仪是1969年发展起来的一种机型，它的全部检验过程是在一个类似离心机转头样的圆盘上完
7、成的。n离心式分析仪由加样和分析两个部分组成。n加样部分：包括样品盘、试剂盘、吸样臂、试剂臂和电子控制部分等。n分析部分：除安装有特殊的离心转盘外，还有温控和光学检测系统，以及微机信息处理和显示系统。2022-10-1（二）工作原理（二）工作原理n特点：在整个分析过程中的每一个步骤几乎是同时完成的同步分析。样品量和试剂量均为微量级（样品1-50l，试剂120-130l），分析速度快（可达600 tests/h）。n此类仪器按照设计不同可用光度法、浊度法和散射法及终点法和动态法进行分析。2022-10-1三、干化学式自动生物化学分析仪三、干化学式自动生物化学分析仪（一）工作原理（一）工作原理 n
8、干化学式分析仪是采用干化学（dry chemistry）方法，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用分光检测系统进行检测的一类新型仪器。n多采用多层薄膜(multiple layer film)的固相试剂技术，仅需将样品加在固相试剂上进行测定。n当编有条形码的特定试验的试条、试片或袋式试剂包放进测定装置后，其贮存的信息就变成测定功能，直至最后报出结果。n干化学分析仪大都采用反射光度法(reflectance spectroscopy)和基于离子选择电极(ion selective electrode，ISE)的差示电位法(differential potentiometry)。
9、2022-10-1（二）仪器的类型及特点n1.反射光度法系统:使用的是试纸条，每一个检测项目都有各自专用的试剂条，由3个主要部分组成：密码磁带：位于剂试条背面,是该项目的全部检测程序。血浆分离区：位于正面下部并标以红色,由玻璃纤维和纸层构成。反应区：位于试剂条的正面上部。n2.胶片涂层技术的化学分析系统:使用试剂片（块），采用的是胶片涂层技术,各种反应都在干片(多层膜片)内进行。其工作原理为：应用涂层技术制作胶片基础的感光乳剂，将其均匀呈层状地涂布在支持层或下层上。n3.袋式分析仪:采用袋式的干试剂包进行临床化学分析。袋式试剂包由透明的双层塑料薄膜制成，每袋均有不同的测定项目英文缩写标记。测定
10、操作开始时将试剂包放进仪器，样品及其稀释液由探针刺孔注入包内，在反应过程中的不同阶段，试剂小袋经破裂器击碎，混合及保温，然后透明小袋经机械碾压形成比色杯用于测定，最后通过计算机系统换算结果并发出报告。2022-10-1四、分立式自动生化分析仪四、分立式自动生化分析仪（一）工作原理（一）工作原理 n分立式自动生化分析仪是按人工操作的方式编排程序，并以有序的机械动作代替人工，按程序依次完成各项操作的自动分析仪器。仪器操作过程中的各环节用传送带连接，按程序依次操作。2022-10-1 （二）基本结构 1.样品盘或样品架 样品盘（specimen disc）：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯
11、（specimen cup）或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。2022-10-1 样品架（specimen stock）：每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品架的移动通过样品传送带来进行。样品架上的条形码（barcode）或编码孔可识别样品架号及样品位置号。2022-10-1样品架的优点随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块（analysisdie-block）甚至另一台分析仪上再进行分析。2022-10-12.试剂室和试剂瓶 转盘式试剂室（reagent chamb
12、er）：内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置3045种试剂瓶。试剂瓶容量一般为10100ml。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。2022-10-1 试剂架式试剂室：可放置容量为250ml500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染。但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。2022-10-1 大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能
13、。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪器能自动识别试剂的种类、批号和有效期。试剂室均具有冷藏装置，可将试剂保存在410。2022-10-13.反应杯和反应盘 反应杯（reaction cup）是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有0.50.7厘米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。2022-10-1 反应盘（reaction disc）：100只或更多的反应杯围成一圈组成。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过检
14、测窗口的比色杯可进行吸光度检测。2022-10-14.取样和加试剂装置(1)取样装置（sampling assembly）：由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品并加入到反应杯。不同分析仪的取样容量有不同的范围，一般为235l，步进0.1微升不等。2022-10-1 取样针设有电子液面感应器，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试管上机测定2022-10-1 多数加样装置设有防撞功能，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警功能，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳
15、过当前样品，进行下一个样品的取样检测。2022-10-1取样针防交叉污染（crossing contamination）措施 绝大多数采用水洗方式（又有瀑布式和涌泉式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液（chemical inertiafluid）膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。2022-10-1(2)加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20350l。步进15微升不等，取样精度在1微升左右。注射器方式：组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。灌注式：具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂
16、单独使用一条试剂管路和喷嘴，不存在各试剂间的交叉污染。2022-10-1 大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第一试剂和第二试剂，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。2022-10-15.混匀与搅拌装置 反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动式搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。2022-10-16.温控和定时系统(1)温控系统 温控系统
17、使反应杯浸浴在恒温环境：恒温循环水浴方式：温度传递速度快，保养要求较高。恒温空气浴方式：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度0.1。规定温度可有37和30两种选择，一般固定在37。2022-10-1 不同分析仪对检测吸光度的间隔时间有不同的规定，反应时间应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在8.5-10min内，个别分析仪可以设定为15或22min等。(2)定时系统：2022-10-17.光路和检测系统 自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成
18、。2022-10-1(1)光源（light source）一般为卤素钨丝灯（halogentungsten filamentlamp），也有采用长寿命的氙灯（xe lamp），要求在340800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。2022-10-1(2)单色器（monochromato）干涉滤光片（interference filter）分光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常用，且不能同一时刻进行多波长检测。光栅（raster）分光系统：常在340（
19、或293）800nm范围内选择1013种固定的单色光。2022-10-1前分光和后分光方式 光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为前分光。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动部分，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。2022-10-1 光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数，后分光方式 选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算。2022-10-1光路无可移动部分，不需要移动仪器的任何部件。可同时选择双波长
20、或多波长进行测定，大大降低noise,有效抑制标本混浊、溶血等因素对结果的影响。n与前分光系统相比较，后分光光路系统的优越性？2022-10-1(3)检测器（detector）由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。2022-10-18.数据处理系统 具有多种数据处理功能。n 计算测定结果 n 判断结果准确性 n 保存各种数据 n 自我诊断功能 2022-10-19.清洗系统 反应杯清洗装置：一个反应杯内反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂（detergent）冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，
21、然后做杯空白的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；更高级仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。2022-10-1样品针、试剂针和搅拌棒清洗 一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。清洗剂可配有1至3种可供选择，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。2022-10-1第二节第二节 组合式自动分析仪组合式自动分析仪 一、组合式自动生化分析仪一、组合式自动生化分析仪 将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即
22、进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于离子选择电极(ISE)的电解质分析模块，甚至还可组合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。2022-10-1组合式分析仪组合式分析仪2022-10-1二、实验室自动化系统二、实验室自动化系统（laboratory automation system，LASLAS）包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增加，只需添加需要的新模块，将其安
23、装连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。2022-10-1样品前处理系统样品前处理系统 能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。也可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室的全自动化。检验周转期的时间分配中，分析前
24、:65%、样品运送2%、分析中15%、分析后18%，实验分析前自动化是全实验室自动化的重点2022-10-1第三节第三节 生化自动化分析方法概要生化自动化分析方法概要一、一、分析方法分类分析方法分类（一）（一）终点法终点法（end assay)（最常用的方法）被测物质在反应过程中完全被转变为被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从该法称为平衡法更为恰当。从时间时间-吸光度曲线吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点来看，到达反应终点或平衡点时，时，
25、吸光度将不再变化吸光度将不再变化。终点法参数设置。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。简单，反应时间一般较长，精密度较好。2022-10-1终点时间的确定终点时间的确定根据时间根据时间-吸光度曲线来确定，吸光度曲线来确定，根据被测物反应终点，结合干扰物的反根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。应情况来确定。2022-10-11一点终点法一点终点法（one point end assay）在反应到达终点，即在时间在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。用于计算结果。结果计算
26、公式：待测物浓度结果计算公式：待测物浓度C CU U=（待测吸光度待测吸光度A AU U试剂空白吸光度试剂空白吸光度A AB B）K KK K为校准系数为校准系数 2022-10-1一点终点法反应曲线一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法 B双试剂一点终点法 R:reagent(试剂)本方法：用来测定总蛋白、清蛋白、葡萄糖氧化酶2022-10-12两点终点法两点终点法（two point end assay）在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用
27、于计算结第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。果。计算公式为：计算公式为：C CU U=（待测吸光度待测吸光度A A2 2待测吸光度待测吸光度A A1 1）K K。2022-10-1两点终点法反应曲线两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 B双试剂两点终点法 2022-10-1 该法能有效地消除该法能有效地消除溶血溶血(hemolysis)hemolysis)、黄疸（黄疸（icterusicterus）和和脂浊（脂浊（lipo-turbidlipo-turbid）等样品本身光吸收造等样品本身光吸收造成的干扰。成的干扰。血红蛋白、胆红素和脂浊的血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线光吸收曲线
28、2022-10-1（二）固定时间法（二）固定时间法（fixed-time assay）指在时间指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法称此法为两点法 。计算公式与两点终点法相同，计算公式与两点终点法相同，C CU U=(A=(A2 2-A-A1 1)K K。2022-10-1固定时间法反应曲线固定时间法反应曲线 A单试剂固定时间法 B双试剂固定时间法该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题该分析方法
29、有助于解决某些反应的非特异性问题。2022-10-1（三）（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring assay）又称又称速率法速率法（rate assayrate assay），），是在测定酶是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（位吸光度变化值（A/minA/min）计算结果。计算结果。2022-10-1连续监测法反应曲线连续监测法反应曲线 A单试剂连续
30、监测法 B双试剂连续监测法 2022-10-1酶促反应的线性段酶促反应的线性段 1 1及及5 5值偏小，而值偏小，而2 23 34 4，故故A A1 1点至点至A A4 4点属线性段点属线性段 2022-10-1连续监测法的优点连续监测法的优点 可以确定线性期并计算可以确定线性期并计算A/minA/min，根据此根据此值再准确地计算酶活性，因而使值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。物浓度，一般是
31、某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（酶活性（U/LU/L）A/minA/min理论（或校准）理论（或校准）K K值。值。代谢物浓度代谢物浓度C CU U=A/min=A/min校准校准K K值。值。2022-10-11 1理论理论K K值值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：义得出酶活性的计算公式为：酶活性酶活性(U/L)=A/minU/L)=A/min将此式中将此式中 以以K K来表示，即为来表示，即为理论理论K K值值 可作为分析参数输入到分析仪中。可作为分
32、析参数输入到分析仪中。dSTTV310dSTTV3102022-10-1采用理论采用理论K K值的前提值的前提 应当是样品和试剂的加量准确、比色杯应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。温度的影响有时也非常大。2022-10-12.2.实际摩尔吸光系数和实际摩尔吸光系数和K K
33、值测定值测定n 由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。2022-10-1（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定摩尔吸光系数的测定 NADH(NADH(还原型辅酶I)（NADPHNADPH）(还原型辅酶)没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用又较差，不能直接用NADH NADH 或或NADPHNADPH标准液来校标准液来校正仪器，须通过有正仪器，须通过有NADNAD+(NADP(NADP+)参与的反应途径。参
34、与的反应途径。2022-10-1n用已糖激酶用已糖激酶(HK)HK)或葡萄糖脱氢酶或葡萄糖脱氢酶(GD)GD)方法方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADHNADH的生成的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。n根据公式根据公式A=bCA=bC，已知比色杯光径已知比色杯光径b b和葡萄和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A A后便可计算出后便可计算出NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系的摩尔吸光系数数为为 A/bCA/bC。2022-10-1测定方法测定方法 葡萄糖标准液浓
35、度为葡萄糖标准液浓度为1 1Ommo1/L(0.01mol/L)Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液标准液加入量为加入量为3.53.5LL，酶试剂加入量为酶试剂加入量为335335LL，比色杯光径比色杯光径为为0.70.7cmcm，在在340340nmnm测得吸光度为测得吸光度为0.4650.465，则实测，则实测NADHNADH摩摩尔吸光系数尔吸光系数 =64246424，即在此台分析仪上，即在此台分析仪上340340nmnm波长处测得波长处测得NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系数为的摩尔吸光系数为64246424，而理论上而理论上NADHNADH（NADPHNAD
36、PH）的的为为62206220。5.33355.301.07.0465.02022-10-1（2 2）“色素原色素原”酶促产物酶促产物在在405405nmnm波长摩尔吸光系数的测定波长摩尔吸光系数的测定 有许多酶底物为人工合成的有许多酶底物为人工合成的“色素原色素原”底物，其本身无色，经底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在酶作用后释放出有色的反应产物，在405405nmnm波长具有吸收峰。波长具有吸收峰。ALPALP底物：底物：磷酸对硝基苯酚磷酸对硝基苯酚(4-(4-Nitrophenyl phosphateNitrophenyl phosphate，4-NPP)4-NPP)经
37、酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-(4-NitrophenolNitrophenol，4-NP)4-NP)GGTGGT底物：底物：-L-L-谷氨酰对硝基苯胺谷氨酰对硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或或-L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羟基羟基-对硝基苯胺对硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroan
38、ilinep-Nitroaniline，4-NA)4-NA)或对硝基或对硝基-5-5-氨基苯甲酸氨基苯甲酸(2-(2-amino-nitrobenzoicacidamino-nitrobenzoicacid，ANBA)ANBA)。2022-10-1以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：试剂：4-4-NPNP标准储存液标准储存液(1(1Ommo1/L)Ommo1/L)4-NP 4-NP标准应用液标准应用液(2.5(2.5mmo1/Lmmo1/L，以以0.840.84mol/L mol/L AMPAMP缓冲液稀释而成缓冲液稀释而成)底物缓冲液底物缓冲液(l5mm
39、ol/L 4-NPPl5mmol/L 4-NPP配于配于0.840.84mol/L mol/L AMP-HCLAMP-HCL缓冲液中，缓冲液中，37,37,pH l0.09pH l0.09土土0.02)0.02)。2022-10-1测定测定方法方法 4-4-NPNP标准液加入量为标准液加入量为5 5LL，底物缓冲液底物缓冲液加入量为加入量为350350LL，波长波长405405nmnm，光径光径0.70.7cmcm，温度温度3737，测定得吸光度为，测定得吸光度为A A1 1；另用蒸馏水另用蒸馏水代替代替4-4-NPNP标准液，按上述方法测定其吸光度标准液，按上述方法测定其吸光度为为A A2
40、2，4-NP4-NP标准液吸光度标准液吸光度A=AA=A1 1-A-A2 2，若测若测得得AA为为0.4600.460，则实测，则实测4-4-NPNP摩尔吸光系数摩尔吸光系数18662 18662 2022-10-13校准校准K K值值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用用校准品能进行补
41、偿。一般来说以使用校准校准K K值值为好，但必须有两个先决条件：必须使用为好，但必须有两个先决条件：必须使用配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有品，该校准品应具有溯源性溯源性。2022-10-1（四）透射比浊法（四）透射比浊法 抗原与相应的抗体结合形成的抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行度法进行透射比浊透射比浊（transmission transmission turbidimetryturbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和
42、药测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做物浓度等的测定。该法须做多点校准多点校准，再经，再经非非线性回归线性回归，求出抗原或抗体的含量。，求出抗原或抗体的含量。2022-10-1二、常用生化检测项目分析方法举例二、常用生化检测项目分析方法举例 1 1终点法检测终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿
43、酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。苯胺蓝法）等。2022-10-12 2固定时间法固定时间法苦味酸法测苦味酸法测定肌酐采用此定肌酐采用此法法。2022-10-13 3连续监测法连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移如：丙氨酸氨基转移酶
44、、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨氨酰谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。等，也可用连续监测法。2022-10-14 4透射比浊法透射比浊法 透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应可用于测定产生浊度反应的项目，多数属的项目，多数属免疫比浊法免疫比浊法，载脂蛋白、，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗免疫球蛋白、补体、抗“O”O”、类风湿因类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、子，以及血清中的其他蛋白质
45、如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。2022-10-1第四节第四节 分析参数设置分析参数设置 各种测定项目的各种测定项目的分析参数分析参数（analysisanalysisparameteparamete）大部分已设计好，存于磁盘中，供大部分已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确
46、切意义。理解各参数的确切意义。2022-10-1一、分析参数介绍一、分析参数介绍（一）（一）必选分析参数必选分析参数 1 1试验名称试验名称（test codetest code）2 2方法类型方法类型（也称反应模式）（也称反应模式）(assay mode)assay mode)3 3反应温度反应温度(temperature)temperature)4 4主波长主波长（primary wavelengthprimary wavelength）5 5次波长次波长（secondary wavelengthsecondary wavelength）6.6.反应方向反应方向（response dire
47、ctionresponse direction）7 7样品量样品量（sampling volumesampling volume）8 8第一试剂量第一试剂量 （first reagent volumefirst reagent volume）9 9第二试剂量第二试剂量（second reagent volumesecond reagent volume）2022-10-11010总反应容量总反应容量（total reacting volumetotal reacting volume）一般一般180-350180-350ll。1111孵育时间孵育时间（incubate timeincubate
48、 time）1212延迟时间延迟时间（delay timedelay time）1313连续监测时间连续监测时间 （continuous monitoring continuous monitoring timetime）一般为一般为6060120120s s，不少于不少于4 4个吸光度检个吸光度检测点（测点（3 3个吸光度变化值）个吸光度变化值）1414校准液校准液（calibratorcalibrator）个数及浓度个数及浓度 1515校准校准K K值值（calibrate coefficientcalibrate coefficient）或理或理 论论K K值值1616线性范围线性范围（
49、linearity rangelinearity range）1717小数点位数小数点位数（decimal point digitdecimal point digit）2022-10-1（二）备选分析参数（二）备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确性有关，这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。检测结果可能不准确。2022-10-11 1样品预稀释样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量
50、三个数值，便可在分析前自动对样品后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。进行高倍稀释。2 2底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limitsubstrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确准确。3 3前区检查前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差有抗原过剩
