1、呼吸疾病基础研究体系建设p 我国呼吸疾病形势严峻p 呼吸系统器官结构复杂，细胞种类繁多 （40种）p 呼吸系统是最开放的脏器，影响因素众多，饱受“内忧外患”临床实践和基础研究结合促进呼吸学科发展基础研究创新的研究技术和新的知识理念临床实践病症解读和临床数据指导指导影响影响基础研究流程p肺纤维化pIPFpTGF-b1-介导的肌成纤维细胞活化1.我要研究什么疾病？研究疾病的某个方面，也就是某个表型？免疫应答 上皮细胞损伤死亡 肌成纤维细胞活化 肌成纤维细胞的凋亡抵抗 肌成纤维细胞来源 细胞间相互作用及微环境 某个信号通路2.我从哪个基因/蛋白入手？分子机制研究离不开基因/蛋白 药物也要通过基因/蛋
2、白起作用pFstl1pFstl1参与肺发育（PNAS，2011）pTGF-b1 诱导的分泌蛋白pMicroarray database from Patients with IPF(Pittsburgh,Yale,Duke，中日医院)移植研究 挖掘数据库 制备数据库（二代测序、基因测序、转录组学）基础研究流程基础研究流程3.确认这个基因/蛋白与疾病表型的相关性？临床验证收集有关标本实验验证：qRT-PCR，Blot，ELISA，IHC 动物模型(in vivo)疾病模型遗传模型：KO,KI,Tg,细胞实验(in vitro)选择要研究的表型的细胞模型Loss-of-functionGain-o
3、f-function基础研究流程4.探讨细胞和分子机制？相关分子、信号通路和生命过程？验证你的基因/蛋白是否与之相关？上下游？验证上述机制与你的表型相关？临床验证 动物模型(in vivo)外植体培养(ex vivo)细胞实验(in vitro)1.临床生物标本库和数据库2.动物模型(in vivo)3.外植体培养(ex vivo)4.细胞和分子生物学实验(in vitro)基础研究体系基础研究体系1：临床生物标本库和数据库n 呼吸疾病研究的基石n 生物标本库：肺泡灌洗液：外周血：血清，血浆，细胞，DNA 肺组织：切片，组织块，RNA 肺细胞：原代成纤维细胞，气道或肺泡上皮细胞，RNA 1.疾
4、病模型 2.遗传模型基础研究体系2：动物模型小鼠作为模式生物的优势：基础研究体系2：动物模型1.1.自发突变自发突变 2.2.ENUENU诱导的点突变诱导的点突变3.3.基因基因knockouts and knock-ins;knockouts and knock-ins;4.4.条件性基因敲除条件性基因敲除;5.5.CRISPR/Cas9CRISPR/Cas96.6.转基因小鼠转基因小鼠丰富的遗传资源：p 多种遗传背景：C57BL/6,BALB/c p 多种遗传操作手段：基础研究体系2：动物模型呼吸疾病相关基因的功能：What?where?when?KO 小鼠致病致病 Vs Vs 保护保护J
5、EM,2015JCI,2010基础研究体系2：动物模型呼吸疾病相关基因的功能：cKO 小鼠Tb bRII CKO:Tbx4rtTA/TetOCre/TRII fx/fxdnTb bRII:Tbx4rtTA/TetOdnTRII基础研究体系2：动物模型J Pathol,2015组织类型组织类型疾病阶段疾病阶段异常重构组织中细胞的命运决定：谱系追踪Rock JR,PNAS,2011基础研究体系2：动物模型DTA:白喉毒素异常重构组织中细胞的命运决定：细胞删除JCI,2016Tbx-CreER;Rosa26-DTA基础研究体系2：动物模型SPF实验动物中心笼位设置笼位设置小鼠数量（只小鼠数量（只/笼
6、）笼）饲养条件饲养条件繁殖笼1，1-2繁殖饲料维持笼1-5维持饲料实验笼1-5根据实验要求特殊处理笼1-5根据实验要求p 饲养和繁育p 动物健康监测1.动物引入设施前的检测2.设施内动物群体的定期抽检3.设施内哨兵鼠的定期检测4.疑似异常小鼠的送检p 动物隔离和净化p 小鼠遗传操作p 胚胎和精子冻存基础研究体系3：外植体培养(ex vivo)肺干细胞的自我更新和分化：3D培养小鼠人ERK/MAPK信号通路与气道形状：胎肺培养Science,2011基础研究体系3：外植体培养(ex vivo)BMP 信号与肺泡结构：肺小切块培养基础研究体系3：外植体培养(ex vivo)PNAS,2011基础研究体系4：细胞、生化和分子生物学(in vitro)p 原代细胞p 细胞系p 基因修饰细胞p 常规的细胞、生化和分子 生物学实验体系p 多学科交叉合作基础研究体系建设中的几个关键问题p 临床生物标本库和数据库：课题的来源、进展和结论 p 充分了解和利用丰富的模式动物资源p 积累各种类型的细胞p 多学科协作p 常规与创新：创新很有可能是从一次意外中得来的精准医学“生态体系”p 患者p 临床医生/临床实验室p 研究人员/基础实验室Bedside bench不断学习不断学习
