1、标准病理组织制片和染色技术第1页，共117页。标准病理组织制片和染色技术第1 页，共1 1 7 页。第2页，共117页。近年来病理技术不断发展，如特殊染色、组 组织制片技术的应用，从1665年由Hook发现细胞开始已300多年 ，最早应用冰冻切片随后又发展了石蜡切片，后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡（聚乙二醇）、塑料、包埋组织而制作切片。第3页，共117页。组织制片技术的应用，从1 6 6 5 年由H 第4页，共117页。从而观察不同的组织、细胞的形态结构，以及细胞第5页，共117页。各种组织制片成切片标本，须要经过一个比较繁多 组织取材、固定、脱水、透明、浸组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋
2、、切片、粘片、烤片、脱蜡、蜡、包埋、切片、粘片、烤片、脱蜡、各级酒精、水洗、常规染色、脱水、透各级酒精、水洗、常规染色、脱水、透明、树胶封固。明、树胶封固。石蜡制片程序石蜡制片程序第6页，共117页。组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片第7页，共117页。冰冻制片程序 组织取材、冰冻切片、干燥粘片、固非切片非切片 （了解内容）（了解内容）1 整体封藏法低等动物自身薄片如：鱼鳞整体封藏法低等动物自身薄片如：鱼鳞片、蛙胚。片、蛙胚。2 涂片法如：血液、精液、痰、胸腹水等涂片法如：血液、精液、痰、胸腹水等3、磨片法主要用有钙盐坚硬材料，牙齿、磨片法主要用有钙盐坚硬材料，牙齿、介壳、坚骨手工磨
3、介壳、坚骨手工磨4 分离法分离法a、压片法动终板的制备、压片法动终板的制备b、撕碎法、撕碎法c压碎法压碎法第8页，共117页。非切片 （了解内容）第8 页，共1 1 7 页。第9页，共117页。二、取材（实验病理、临床病理、尸解诊断）第9 页，共1 1 7 页。第10页，共117页。1、实验病理取材第1 0 页，共1 1 7 页。第11页，共117页。A：断头法：青蛙、小鼠等较小的动物第1 1 页，共1 1 7 页。第12页，共117页。E：放血法：眼球放血（小鼠）第1 2 页，共1 1 7第13页，共117页。(1)取材时所用的刀要锐利，动作仔细，第 第14页，共117页。（3）保持组织清洁
4、：血液，污物，第15页，共117页。2 .临床活检取材：第1 5 页，共1 1 7 页。第16页，共117页。3.尸体解剖组织（脏器）取材：略。第1 6 页，共1 1 7 页。第17页，共117页。三固定（f i x a l i o n）第1 7 页，共1 1 7 页。第18页，共117页。1.固定的目的第1 8 页，共1 1 7 页。第19页，共117页。(4)某些传染性标本，能防止疫病的扩散。第1 9第20页，共117页。2、固定的注意事项：第2 0 页，共1 1 7 页。第21页，共117页。4、固定液的分类、配制和特性第2 1 页，共1 1 7 页。第22页，共117页。(2)常用固定
5、液的配制及性质：第2 2 页，共1 1 7 页。第23页，共117页。1 0%中性甲醛(p h 7.3-7.6)第2 3 页，共1 1 7 页。第24页，共117页。B：酒精第2 4 页，共1 1 7 页。第25页，共117页。C：丙酮：用于酸的固定(磷酸酶、第2 5 页，共1 1 7 页。第26页，共117页。混合固定液第2 6 页，共1 1 7 页。甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。PCONH+HCH+P-CONHOP-CON-C-P-CONHH亚甲基桥肽键甲醛蛋白质分子之进行交换，形成亚甲基桥，把蛋白质分子串联起来，使蛋白变性，破坏了蛋白质的立体结构，达到固定目的。第27页，共
6、117页。3、固定的原理甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。P四、洗涤四、洗涤 组织在固定后，一定要把渗透到组织在固定后，一定要把渗透到里面的固定液里面的固定液(沉淀物或结晶沉淀物或结晶)洗去，洗去，然后再进行下一步程序，洗涤必须彻然后再进行下一步程序，洗涤必须彻底，否则留在组织中的固定液有可能底，否则留在组织中的固定液有可能妨碍染色。妨碍染色。第28页，共117页。四、洗涤第2 8 页，共1 1 7 页。洗涤的原则：洗涤的原则：1、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要 冲洗。冲洗。2、固定液为水配制者，用水流水冲洗、固定液为水配制者，用水流水冲洗3、凡含
7、有铬酸、重铬酸钾的固定液、凡含有铬酸、重铬酸钾的固定液-洗涤洗涤4、含有苦味酸用乙醇配制的固定液、含有苦味酸用乙醇配制的固定液-洗涤洗涤第29页，共117页。洗涤的原则：第2 9 页，共1 1 7 页。5、含有氯化汞固定液、含有氯化汞固定液-冲洗冲洗-碘液去碘液去 汞汞(zenkers)-5%硫化硫酸钠去碘硫化硫酸钠去碘6、洗涤时间大动物组织、洗涤时间大动物组织8h以上、以上、小动物组织小动物组织2-8h洗涤方法：流水冲洗洗涤方法：流水冲洗 第30页，共117页。5、含有氯化汞固定液-冲洗-碘液去第3 0 页，共1 1 7 页。五、脱五、脱 水水脱水就是利用某些化学试剂与水混合内的水份彻底脱脱
8、水就是利用某些化学试剂与水混合内的水份彻底脱除。除。要求：要求：1、脱水剂能与水任何比例混合、脱水剂能与水任何比例混合 2、脱水剂也能与透明剂混合、脱水剂也能与透明剂混合 3、脱水要彻底否则无法进行透明、脱水要彻底否则无法进行透明 4、低浓度、低浓度-高浓度循序进行高浓度循序进行(酒精是依次递增、酒精是依次递增、水是级差递减水是级差递减)常用的各级酒精梯度，达到脱水目的常用的各级酒精梯度，达到脱水目的【60%70%80%90%100%I 100%】第31页，共117页。五、脱 水第3 1 页，共1 1 7 页。乙醇结构式乙醇结构式CH3 CH3 OH水的结构式水的结构式H2OH-O H-O H
9、-O H-O H-HRHR乙醇的羟基（乙醇的羟基（OH）和水形成氢键，）和水形成氢键，水分子与乙醇分子逐步缔合在一起。水分子与乙醇分子逐步缔合在一起。乙醇与水相混容的原理：乙醇与水相混容的原理：第32页，共117页。乙醇结构式 H-O H-O H-常用的脱水剂常用的脱水剂 1、酒精：特点：能力强，使组织硬化，和二甲苯互溶。酒精：特点：能力强，使组织硬化，和二甲苯互溶。缺点：使组织收缩，变脆。缺点：使组织收缩，变脆。2、丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用于丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用于快速脱水快速脱水3、二氧陆环：有毒性，既脱水又透明使组织收缩小不硬二氧陆环：有毒性，既脱水又透
10、明使组织收缩小不硬化化4、正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨 叔丁醇发松子叔丁醇发松子醇醇5、脱水时间：脱水时间：根据组织大小、类别、种属、分别安排根据组织大小、类别、种属、分别安排第33页，共117页。常用的脱水剂 第3 3 页，共1 1 7 页。六、透明六、透明(clearing)组织经脱水后，不能直接浸入石蜡组织经脱水后，不能直接浸入石蜡中，还要一个媒剂透明过程。透明剂既中，还要一个媒剂透明过程。透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，当组织中全部被透明剂起到桥梁作用，当组织中全部被透明剂点有时，光线
11、可以透过呈现透明状态点有时，光线可以透过呈现透明状态-称称组织透明。组织透明。第34页，共117页。六、透明(c l e a r i n g)第3 4 页，共1 1 7 页。常用的透明剂常用的透明剂 1、二甲苯：易挥发、易燃、透明力强、收缩、变脆二甲苯：易挥发、易燃、透明力强、收缩、变脆(能与无水乙醇相混合，又能与石蜡相混合，作两组能与无水乙醇相混合，又能与石蜡相混合，作两组透明。透明。)2、氯仿：比二甲苯透明力强，不收缩、变脆。时间长氯仿：比二甲苯透明力强，不收缩、变脆。时间长24h，收缩小，收缩小3、苯：甲苯和二甲苯相同。易挥发、易燃、有毒性苯：甲苯和二甲苯相同。易挥发、易燃、有毒性香柏油
12、香柏油 第35页，共117页。常用的透明剂 第3 5 页，共1 1 7 页。5.苯甲酸甲酯苯甲酸甲酯-收缩小、时间收缩小、时间1224h，常用为火棉胶切片，常用为火棉胶切片 6.俄甘油俄甘油7.苯酚苯酚第36页，共117页。苯甲酸甲酯-收缩小、时间1 2 2 4 h，常用为火棉胶切片 第3透明时间：眼观组织呈透明状态透明时间：眼观组织呈透明状态小组织小组织 10min中组织中组织 20-40 min大组织大组织 1-2h(如果组织不透明如果组织不透明1、脱水、脱水未尽未尽2、组织太厚、组织太厚3、时间不够、时间不够)第37页，共117页。透明时间：眼观组织呈透明状态第3 7 页，共1 1 7
13、页。七、浸蜡（七、浸蜡（Infilftrition）组织经过媒剂的透明作用后，移组织经过媒剂的透明作用后，移入熔化的石蜡内浸渍称为浸蜡。入熔化的石蜡内浸渍称为浸蜡。第38页，共117页。七、浸蜡（I n f i l f t r i t i o n）第3 8 页，共1 1 7 页。、石蜡：石蜡：切片蜡切片蜡_软蜡软蜡50以下，酶，保存抗原活性以下，酶，保存抗原活性(纯度高密度好纯度高密度好)硬蜡硬蜡50以上以上-6264工业石蜡工业石蜡_质地较差，价格便宜质地较差，价格便宜 纯度低，熔点不准确纯度低，熔点不准确2、根据组织的不同选用：、根据组织的不同选用：6062-皮肤、骨组织、硬纤维瘤皮肤、骨
14、组织、硬纤维瘤58以下以下-作免疫组化酶作免疫组化酶 第39页，共117页。、石蜡：第3 9 页，共1 1 7 页。3、恒温箱温度一般高于石蜡熔点、恒温箱温度一般高于石蜡熔点454、浸蜡可分三级、浸蜡可分三级 软蜡软蜡 54-56 硬蜡硬蜡 58-60 硬蜡硬蜡 6062第40页，共117页。3、恒温箱温度一般高于石蜡熔点4 5 第4 0 页，共1 1 7 页。5、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表小动物组织（鼠）脱水、透明和浸蜡时间表小动物组织（鼠）脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可乙醇时间长短均可285%乙醇乙醇 25h395%乙醇乙
15、醇 25h495%乙醇乙醇 25h5无水乙醇无水乙醇20min6 无水乙醇无水乙醇30min7无水乙醇无水乙醇30min8二甲苯二甲苯15min9二甲苯二甲苯30min 10 二甲苯二甲苯 30min11 石蜡石蜡5658 30min12 石蜡石蜡5658 30min13 石蜡石蜡6062 12h第41页，共117页。5、脱水、透明、浸蜡时间表小动物组织（鼠）脱水、透明和浸蜡时5、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表外检组织脱水、透明和浸蜡时间表外检组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配185%乙醇时间长短均可乙醇时间长短均可295%乙醇乙醇 12h395%乙醇乙
16、醇 12h495%乙醇乙醇 12h5无水乙醇无水乙醇12h6 无水乙醇无水乙醇12h7无水乙醇无水乙醇12h8二甲苯二甲苯1h9二甲苯二甲苯 12h10 二甲苯二甲苯 12h11 石蜡石蜡5658 12h12 石蜡石蜡5658 12h13 石蜡石蜡6062 24h第42页，共117页。5、脱水、透明、浸蜡时间表外检组织脱水、透明和浸蜡时间表程序5、脱水、透明、浸蜡时间表尸体解剖组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可285%乙醇 510h395%乙醇 510h495%乙醇 510h5无水乙醇25h6 无水乙醇25h7无水乙醇 25h8二甲苯30min左右9二甲苯12h
17、10 二甲苯 12h11 石蜡5658 12h12 石蜡5658 12h13 石蜡6062 24h第43页，共117页。5、脱水、透明、浸蜡时间表尸体解剖组织脱水、透明和浸蜡时间表5、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可乙醇时间长短均可285%乙醇乙醇 25h395%乙醇乙醇 25h495%乙醇乙醇 25h5无水乙醇无水乙醇30min6 无水乙醇无水乙醇30min7无水乙醇无水乙醇 12h8二甲苯二甲苯30min9二甲苯二甲苯30min10 二甲苯二甲苯 1h左右左
18、右11 石蜡石蜡5658 30min12 石蜡石蜡5658 12h13 石蜡石蜡6062 23h第44页，共117页。5、脱水、透明、浸蜡时间表大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表程八、包埋（八、包埋（Emledding）组织经过固定、脱水、透明、后再用石蜡组织经过固定、脱水、透明、后再用石蜡铸成蜡块称包埋。铸成蜡块称包埋。1.埋石蜡的要求：埋石蜡的要求：(1)尽可能和浸蜡熔尽可能和浸蜡熔点一致点一致(2)南方：南方：5862 北方：北方：5258 2.方法：方法：第45页，共117页。八、包埋（E m l e d d i n g）第4 5 页，共1 1 7 页。3.(1)最大平面向下压平最大平面
19、向下压平 (2)管状管状 束壁束壁 皮肤皮肤 竖埋竖埋 (3)包埋石蜡温度高于石蜡熔包埋石蜡温度高于石蜡熔 点点57 (4)石蜡凝固后打开蜡框修整石蜡凝固后打开蜡框修整 蜡块蜡块 (5)贴好标签贴好标签 第46页，共117页。3.(1)最大平面向下压平第4 6 页，共1 1 7 页。九、石蜡切片法九、石蜡切片法 1.切片前的准备工作：切片前的准备工作：(1)切片机切片机A：轮转切片机：轮转切片机 B：平推式切片机：平推式切片机(2)刀片刀片(刀刀)一次性刀片或切片刀一次性刀片或切片刀(磨刀磨刀)(3)清洁的载玻片清洁的载玻片(4)甘蛋白油、白胶、毛笔、钙子甘蛋白油、白胶、毛笔、钙子 第47页，
20、共117页。九、石蜡切片法 第4 7 页，共1 1 7 页。2.切片制作过程切片制作过程(实习实习)注意事项：注意事项：a)切片厚度：切片厚度：5um(镜下镜下46um)b)刀片要锋利否则会出现卷片、起皱、不连刀片要锋利否则会出现卷片、起皱、不连 结、破碎不完整。结、破碎不完整。c)刀与组织的角度刀与组织的角度46d)各个部件，螺丝应旋紧否则震动切片厚薄各个部件，螺丝应旋紧否则震动切片厚薄 不均。不均。第48页，共117页。2.切片制作过程(实习)第4 8 页，共1 1 7 页。第49页，共117页。一、染色的目的十、染色第4 9 页，共1 1 7 页。第50页，共117页。二、染色的作用第5
21、 0 页，共1 1 7 页。第51页，共117页。2、物理作用：第5 1 页，共1 1 7 页。1、二甲苯、二甲苯 510min 2、二甲苯、二甲苯 510min 3、无水酒精、无水酒精 30 se1min 4、无水酒精、无水酒精 30 se1min 5、95%酒精酒精 30 se1min 6、95%酒精酒精 30 se1min 7、90%酒精酒精 30 se1min 8、80%酒精酒精 30 se1min 9、Harris苏木素苏木素 10se15min 10、自来水洗、自来水洗 30sec1min 11、1%盐酸酒精盐酸酒精 30sec 12、流水冲洗、流水冲洗1015min或温水洗或温水
22、洗 510min 13、1%伊红染色伊红染色 25min 14、80%乙醇洗去多余的染色乙醇洗去多余的染色 1min 15、90%酒精酒精 301min 16、95%酒精酒精 301min 17、95%酒精酒精 301min 18、100%酒精酒精 301min 19、100%酒精酒精 301min 20、石碳酸二甲苯、石碳酸二甲苯 1min 21、二甲苯、二甲苯 1min 22、二甲苯、二甲苯 1min 23、二甲苯、二甲苯 1min 24、中性树胶封固、中性树胶封固 HEHE染色法程序染色法程序第52页，共117页。1、二甲苯 5 1 0 m i n 2、二甲苯 5 1 0 m i n 3
23、、第53页，共117页。结果：细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深蓝色；细胞浆深浅不同的粉第54页，共117页。染色时的注意事项第5 4 页，共1 1 7 页。第55页，共117页。（4）切片在苏木素的染色时间应充分宁过勿不足。对于初学者来说第56页，共117页。（7）切片致无水酒精后，不要在控干无水酒精时让切片干涸，可以第57页，共117页。（9）滴中性树胶封盖切片，胶不能太浓，太浓胶难以均匀铺开，且第58页，共117页。（1 0）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶第59页，共117页。染液的配制第5 9 页，共1 1 7 页。第60页，共117页。（1）H a r r i s
24、苏木素的配制（H a r r i s.l 9 0 0）第6第61页，共117页。预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取一三角瓶倒入蒸镏水，再加第62页，共117页。（2）Ma y e r 氏苏木素（Ma y e r,1 9 0 3）第6 2 页，共第63页，共117页。将蒸包馏水稍为加温，加入苏木素不停地搅拌直至溶解，再加入钾明第64页，共117页。配制苏木素的注意事项第6 4 页，共1 1 7 页。第65页，共117页。3、冰醋酸一定要在溶液过滤后加入如果过滤前加入，则在过滤时溶第66页，共117页。(二）伊红的配制第6 6 页，共1 1 7 页。第67页，共117页。2.切片染完苏木素后的分
25、化，应该如何控制和注意什么问题？第6胃类癌（瘤细胞小而一致）胃类癌（瘤细胞小而一致）第68页，共117页。胃类癌（瘤细胞小而一致）第6 8 页，共1 1 7 页。瘤细胞的多形性瘤细胞的多形性第69页，共117页。瘤细胞的多形性第6 9 页，共1 1 7 页。病理性核分裂像病理性核分裂像第70页，共117页。病理性核分裂像第7 0 页，共1 1 7 页。平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤第71页，共117页。平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤第7 1 页，共1 1 7 页。大肠腺体、腺瘤和腺癌大肠腺体、腺瘤和腺癌第72页，共117页。大肠腺体、腺瘤和腺癌第7 2 页，共1 1 7
26、 页。正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌第73页，共117页。正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌第7 3 页，共1 1 7 页。淋巴管转移癌淋巴管转移癌第74页，共117页。淋巴管转移癌第7 4 页，共1 1 7 页。肺淋巴管转移癌肺淋巴管转移癌第75页，共117页。肺淋巴管转移癌第7 5 页，共1 1 7 页。冰冻切片第76页，共117页。冰冻切片第7 6 页，共1 1 7 页。第77页，共117页。一、种类：第7 7 页，共1 1 7 页。第78页，共117页。二、冰冻切片的目的第7 8 页，共1 1 7 页。第79页，共117页。3、对于已确定恶性肿瘤的
27、病人则需要了解其手术范围是否足够，上第80页，共117页。三、冰冻切片的操作第8 0 页，共1 1 7 页。第81页，共117页。有即时除霜键，启动该键机器可持续工作1 5 分钟，将工作间顶部后第82页，共117页。（2）切片取末经固定的组织不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难第83页，共117页。（5）调好厚度，根椐不同的组织而定，一般在5-1 0 u m.第8第84页，共117页。（7）用于附贴切片的载片，不能存放入冷冻的地方，于室温存放即第85页，共117页。（8）应视不同的组织选择不同冰冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主第86页，共117页。四、冰冻切片时的注意事项第8 6 页，共1 1 7
28、 页。第87页，共117页。3、冰冻组织前组织放于组织支承器上应视组织的走势来给予放置，第88页，共117页。4、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液在未能达到第89页，共117页。5、当切片时，如果发现组织冰冻过度时，可将冰冻的组织取出来，第90页，共117页。五、冰冻切片的快速染色第9 0 页，共1 1 7 页。第91页，共117页。2、超声波快速染色法第9 1 页，共1 1 7 页。第92页，共117页。结果：经上述各种方法的处理后所制作的切片。细胞核呈蓝色，软骨第93页，共117页。第9 3 页，共1 1 7 页。第94页，共117页。第9 4 页，共1 1 7 页。第95页
29、，共117页。第9 5 页，共1 1 7 页。第96页，共117页。第9 6 页，共1 1 7 页。第97页，共117页。第9 7 页，共1 1 7 页。石蜡6062 24h左边的切片台可达到-60左右，冷冻箱内在0-30间可任意调节，箱面上有电子控制板，装有急速冷冻，即放上标本启动该键机器马上进行冷冻工作并持续10分钟；第25页，共117页。(3)包埋石蜡温度高于石蜡熔（脱落细胞、培养细胞也常用）第112页，共117页。无水乙醇25h石蜡5658 12h95%酒精850ml95%乙醇 25h第17页，共117页。（10）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶盖难以打开。石蜡56
30、58 30min硬蜡 58-60（10）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶盖难以打开。第98页，共117页。石蜡6 0 6 2 2 4 h 第9 8 页，共1 1 7 页。第99页，共117页。第9 9 页，共1 1 7 页。第100页，共117页。第1 0 0 页，共1 1 7 页。第101页，共117页。第1 0 1 页，共1 1 7 页。第102页，共117页。第1 0 2 页，共1 1 7 页。第103页，共117页。第1 0 3 页，共1 1 7 页。第104页，共117页。第1 0 4 页，共1 1 7 页。第105页，共117页。第1 0 5 页，共1 1 7
31、页。第106页，共117页。第1 0 6 页，共1 1 7 页。第107页，共117页。第1 0 7 页，共1 1 7 页。第108页，共117页。第1 0 8 页，共1 1 7 页。第109页，共117页。第1 0 9 页，共1 1 7 页。第110页，共117页。第1 1 0 页，共1 1 7 页。第111页，共117页。第1 1 1 页，共1 1 7 页。第112页，共117页。第1 1 2 页，共1 1 7 页。第113页，共117页。第1 1 3 页，共1 1 7 页。第114页，共117页。第1 1 4 页，共1 1 7 页。第115页，共117页。第1 1 5 页，共1 1 7 页。第116页，共117页。第1 1 6 页，共1 1 7 页。第117页，共117页。第1 1 7 页，共1 1 7 页。
