1、耐酸耐热菌（库克）的检测方法1 适用范围本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。2 仪器和试剂2.1 恒温水浴：801。2.2 恒温培养箱：401。2.3 灭菌培养皿：直径为90mm。2.4 灭菌试管：18180mm。2.5 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。2.6 酵母粉。 2.7 蛋白胨。2.8 琼脂粉。 2.9 葡萄糖。 2.10 吐温80。2.11 12.5%苹果酸。2.12 灭菌蒸馏水。2.13 K氏培养基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐温80，使其溶解，轻轻
2、盖上三角瓶的盖子，在121灭菌25分钟；在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸，搅拌直至溶解，将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤，将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中，搅拌均匀，使其pH值达到3.70.1。当冷却到大约50时，将K氏培养基倾注到培养皿中，凝固后在0-5的冰箱中储存，有效期60天，并记录配制日期。3 操作步骤3.1 样品处理3.1.1 浓缩清汁：打开水浴锅，调整温度到801。以无菌操作，取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中，再移取10ml浓缩清汁于另一带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放
3、在水浴锅中，当温度达到801，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。3.1.2 清汁、水：打开水浴锅，调整温度到801。以无菌操作，取150ml清汁（或水）于已灭过菌的玻璃样品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一带有温度计的玻璃样品瓶中，作为温度控制用，盖上样品瓶的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到801，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。将热处理过的样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。3.1.3 浊汁：打开水浴锅，调整温
4、度到801。以无菌操作,取20ml浊汁于已灭过菌的试管中,再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到801时,开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤。3.2 培养及计数取掉过滤器的上部装置，用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，轻敲数次，以保证滤膜与培养基接触。倒置于40-41恒温培养箱中，在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5天。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。根据对样品的污染情况，
5、可选择稀释度。用灭菌吸管吸取25ml样品，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：10的稀释度；用灭菌吸管吸取1：10的稀释液25ml，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：100的稀释度，稀释后的样品的检测方法同上。培养结束后，记录滤膜上的菌落数，并按相应的稀释度进行计算。4 数据处理结果报告10ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/10ml。结果报告150ml的清汁（或水）样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/150ml。结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/20ml。参考资料：库克实验室耐热耐酸菌的检测方法。NDM耐酸耐热菌检验1 适用范围本方法适用于清
6、汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。2 仪器和试剂2.1 恒温水浴锅：7012.2 恒温培养箱：451。2.3 灭菌培养皿：直径为90mm。2.4 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。2.5 灭菌三角瓶：500ml。2.6 灭菌蒸馏水。2.7 YSG培养基的配制：A组：酵母粉（MERCK）： 2.0g葡萄糖： 1.0g可溶性淀粉(MERCK)： 2.0g蒸馏水： 500ml把A组用1-2N硫酸或盐酸调至PH为3.70.1；B组：琼脂（MERCK）： 15.0g蒸馏水： 500ml把A组和B组分别在121 15分钟条件下灭菌，冷却至5060，把两者混合。3 操作步骤3.1 取样品50ml于
7、一个无菌瓶中，另取同样品同体积于一个相同的瓶中做温度控制用，在温度控制瓶中插入温度计。3.2 把两个瓶都放入到70的水浴中。(水浴锅中的水面应高于瓶中的样品)，当温度控制瓶中的温度计达到70时，开始计时20分钟。3.3 20分钟后，迅速将样品放入冰浴。3.4 将经过热处理的样品加灭菌水稀释，稀释倍数约10倍左右。用真空泵将此样品全部通过0.45 m的滤膜。用灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器。确信这张膜被真空抽干。将这张滤膜放到YSG培养基上。为了防止气泡，小心的使滤膜滚贴到YSG培养基上，并且用无菌的镊子轻敲滤膜，使滤膜的边缘紧贴在培养基上。3.5 将此培养基在45培养 3-5天。3.6 计数平
8、板上所有的菌落4 数据处理检出的耐酸耐热菌以cfu/50ml报告。参考资料：日本NDM公司耐热耐酸菌的检测。纯品耐热耐酸菌的检测方法1 目的检测浓缩汁中环脂芽孢杆菌和其它的耐酸耐热菌。这个程序含有经过改进的检测方法和NFPA的建议。2 原理/概述这个程序描述了果汁和浓缩汁中环脂芽孢杆菌和其它的耐酸耐热菌的检测方法。它是以抗热芽孢的生长为基础进行检测的。抗热芽孢在较高温度和酸性环境中萌发生长。通过ribotyping和2-甲氧基酚（俞创木粉）的化学测试来检定环脂芽孢杆菌，俞创木粉是通过气相色谱分析的方法（固相微提取）来进行检测。3 范围和应用检测浓缩汁中的环脂芽孢杆菌，从不同种类的果汁和浓缩汁中
9、分离耐酸耐热菌，例如橙汁、白葡萄汁、酸果蔓的果实、悬钩子、梨和西红柿。4 仪器和化学药品2.1 恒温培养箱：431。2.2 高压灭菌锅。2.3 恒温水浴锅：801。2.4 K氏培养基。2.5 25%无菌苹果酸。2.6 灭菌吸管：1ml 和10 ml。2.7 灭菌培养皿。2.8 无菌2050mm螺旋盖的盖子。5 培养基的制备（酸化K氏培养基）酵母浸膏： 2.5g蛋白胨： 5.0-g琼脂粉： 15.0-g葡萄糖： 1.0-g吐温80： 1.0-ml 3.1将上述试剂加入到990ml蒸馏水中，溶解后混匀，煮沸，然后在121灭菌15分钟。3.2 在烧杯中，将25克苹果酸加入到100ml去离子水中，混匀
10、。3.3 用0.20um的滤膜过滤除菌，然后将过滤液10ml加入到990ml在121灭菌15min且冷却到451的培养基中。3.4 检测PH，如果需要，用无菌苹果酸或1N NaOH调整PH到3.70.1。3.5 也可以从International Bioproducts购买脱水K氏培养基。按照厂家的说明，将培养基冷却到48，用6ml的25%的过滤除菌的苹果酸调整PH为3.70.1。6 样品采集用无菌容器采集样品。采集样品时要小心，防止交叉污染。7 样品制备5.1 浓缩果汁5.1.1将10ml样品加入到无菌瓶中或无菌的带有螺旋盖的2050mm的试管中。5.1.2将样品放在80的水浴锅中，用一样的
11、试管或瓶子，合适的温度计检测温度，当样品温度达到80时开始计时10分钟。5.1.3确保果汁的上液位应在水面下面。5.1.4热冲击结束后，将样品放在冷水或冰水中迅速冷却。5.2 原汁5.2.1取10 ml样品加入到无菌瓶中或无菌的带有螺旋盖的2050mm的试管中。5.2.2不进行热冲击。6 平板制备6.1 向每个Petri dishes 平板上倾注1ml样品，平行三份。6.2 在每个平板上倾注23ml PH 3.7的温度为451的K氏培养基。6.3 倾注时，培养基应厚一些，防止在43变干。6.4 将培养基已经凝固的平板在431培养3天。为了观察到好的菌落形态，如果必要，培养时间可以延长1-2天，
12、也可将平板放在袋中进行培养以防止变干。8 数据分析浓缩汁/原汁：对三个平行平板上的菌落计数，结果以cfu/3ml报出。9 讨论9.1 分离的菌落是不透明的、奶油色、微凸。在显微镜下，中间成杆状，末端有芽孢。对于腐败的微经过热处理的果汁，必须进一步确认以验证这种微生物时代有芽孢的。分离的菌落也可以用PH为3.5的土豆右旋葡萄糖琼脂培养基在431培养5天以使孢子形成。在无菌水中的悬浮孢子，也可用这种方法进行检测。经过热处理存活的孢子通过酸化的K氏培养基进行验证检测。9.2 通过ribotyping和/或气相色谱分析测试俞创木粉来鉴定环脂芽孢杆菌。9.3 用5890 series气相色谱和5970型
13、质谱仪（Hewlett-Packard）在70电子伏特离子能量下进行分析。用分流和无分流注射器。9.4 最低检测限是1.5ppb的2-甲氧基酚，在腐败的果汁（耐酸孢子生长）中，2-甲氧基酚的含量等于或大于1.5ppb，2-甲氧基酚的限量为5.0ppb。参考资料：Evancho,G.M. and I. Walls . 2001.Aciduric flat sour sporeformers,p. 245-24。雀巢耐热耐酸菌的检测方法1 应用的范围和领域这个方法是用来测定果汁中的TAB，脂肪酸结合到环脂芽孢杆菌的细胞膜中，使它更能够抵抗食品中的低酸和商业无菌食品加工中的高温。环脂芽孢杆菌，一种革
14、兰氏阳性芽孢杆菌，通常能够在土壤中发现。水果罐头中不合适的清洗引起加工设备的污染以及最终引起成品的污染。环脂芽孢杆菌的芽孢能够在一些食品的低酸和商业无菌食品加工中的高温中生存，而这个高温是经常用来在加工中破坏食品中的芽孢的。当这种生物体在加工中幸存而引起不知名的危害食品事件的发生时，会给生产厂家带来巨大的经济损失。2 原理一个果汁样品进行热冲击和用0.45m的滤膜进行无菌的过滤。此过滤膜贴在K氏培养基上。在培养皿上培养后进行计数并用显微镜来检查芽孢。3 设备3.1 恒温水浴锅：801C3.2 温度计：0-100C3.3 灭菌移液管：10ml。3.4 带盖子的灭菌试管和试管架：20 x 150
15、mm。3.5 培养箱：431C。3.6 培养皿：60 x 15 mm，#1007， B-D，Falcon Plastics，Oxnard， CA。3.7 0.45um滤膜：灭菌的微孔过滤器， TYPE HA， #HAWG047S0，Millipore Corp， Bedford，MA 01730。3.8 塑料袋。3.9 显微镜，微生物载玻片，盖玻片。3.10灭菌镊子。4 化学试剂4.1 苹果酸。4.2 灭菌的50 ml 蒸馏水空白。4.3 根据厂家提供的说明书准备。分装100 ml能整除的并且在121C 灭菌 15分钟。冷却到45C时，用25% 的苹果酸溶液调节100 ml 的培养基使pH 达
16、到3.7。在使用之前记录加入到每100 ml 的培养基中的总数。每次使用打开新的培养基都要检查pH。如果此培养基难以买到，可以用下面的方法配制：蛋白胨 5 g酵母粉 2.5 g葡萄糖 1.0 g吐温80 1.0 g琼脂粉 15 g.把这些成分加入到990 ml的蒸馏水中，加热使其沸腾。高压灭菌121C 15分钟，使用之前冷却到45C，用25% 灭菌的苹果酸溶液调节pH 达到3.7。4.4 25%的苹果酸，必须经过无菌过滤并且在使用之前加到K氏培养基中。5 操作步骤5.1 样品准备5.1.1 用一个10 ml的广口吸管，以无菌操作移取15 ml样品并且将其加到20150 mm的无菌试管中。另外再
17、取15 ml 样品加入到另一个试管中(温度控制用)，给此试管中插入一个温度计。5.1.2 将两个试管都放入到80C的水浴中。当温度控制用的试管中的温度计达到80C时，开始计时10分钟。水浴锅中的水面应高于试管中的样品。5.1.3 10分钟后，迅速将试管放入冰浴。 5.1.4 将10 ml经过热处理的样品加到50 ml的灭菌水中。5.1.5 用真空泵将此60 ml全部通过0.45 m的滤膜。用10-20 ml的灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器。确信这张膜被真空抽干。将这张滤膜放到K氏培养基上。为了防止气泡，小心的使滤膜贴到K氏培养基上，并用无菌的镊子轻敲滤膜，使滤膜的边缘紧贴在培养基上。5.1.6
18、 用密封的容器(塑料袋)将此培养基在43C 培养3-5天。 6 数据处理6.1 计数平板上所有的菌落并且报告每10 ml 中检出的耐酸耐热菌的结果。6.2 表面菌落应该是不透明的，奶油色，轻微的凸起。6.3 用显微镜来检查杆菌形成的生物体，这些芽孢轻微的膨胀在芽孢囊的顶端，接近端点和中央部位。6.4 环脂芽孢杆菌形成孢子的速度很快，可能在24小时就可以形成。7 注意事项7.1 在热冲击时，保证水浴锅的水面超过试管中样品的液面是很重要的。7.2 提到的美国雀巢的NQA-00.4496的方法，微生物室的内控计划。每个实验室都应该建立自己的内控计划，频率能够适应样品的数目，记录内控计划的结果。7.3
19、 安全预防：已经制定的实验室安全要求必须在所有时间内遵守，包括在实验室工作区域的保护眼睛的措施。此方法中列出的化学药品不是危险品；但是，当处理任何化学药品和反应试剂时都应该小心。配备合适的个人防护设备。8 精度8.1再现性：在同样的条件（同样的化验员，同样的仪器设备，同样的实验室和短暂的时间间隔）下，同一个实验样品检测两次的结果的差异不超过：CVr=5%8.2重复能力：在不同的条件（不同的化验员，不同的仪器设备，不同的实验室和不同的时间）下，同一个实验样品检测两次的结果的差异不超过：CVR=15%定义r:repeatability再现性R:Reproducibility重复能力CVr:Coef
20、ficient of Variation of the repeatability再现性变化的系数CVR:Coefficient of Variation of the Reproducibility重复能力变化的系数见美国雀巢方法NQA-00.0100关于统计评价的详细信息。以上的统计数字是精密度和/或正确度的大致的指导方针。每一个用于此方法的设备仪器都是为了计算用的矩阵详细的再现性 和重复能力的标准负责的。参考资料：见美国雀巢方法NQA-00.4496，微生物实验室内控计划，附加的统计学的信息。耐热霉菌（百事可乐）的检测方法1 适用范围本方法适用于清汁、浊汁、水及浓缩果汁中耐热霉菌的检测。
21、2 仪器和试剂2.1 恒温水浴：801。2.2 恒温培养箱：301。2.3 灭菌培养皿：直径为150mm。2.4 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：按产品说明书配制。2.5 灭菌蒸馏水。3 操作步骤3.1 样品处理3.1.1 浊汁及浓缩果汁：以无菌操作，取50ml检样于无菌稀释瓶中，再添加50ml无菌蒸馏水。3.1.2 清汁：以无菌操作，直接吸取100ml检样于无菌瓶中。3.2 同时称量相似的样品作为温度控制样品。在温度控制瓶中插入温度计，把实验样品瓶和温度控制瓶同时放入80的水浴中。3.3 当温度控制瓶的温度达到801时开始计时，维持30min。3.4 把试验样品瓶放入冰浴中冷却后，平均注入到8个无菌培养皿中。3.5 每个培养皿注入35-40mlPDA琼脂，同时作空白试验。3.6 待琼脂凝固后，翻转平板放入塑料袋中在30下培养14-30天。3.7 培养结束后，计数8个平板上所有的菌落数。4 数据处理浓汁及浊汁以cfu/50ml报告，清汁以cfu/100ml报告。参考资料：参照R&TS Microbioligy lab 耐热霉菌检测方法。
