1、 SRAP标记技术 1 SRAP标记技术的概念 相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一种新型的基于PCR的标记技术，由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士于2019年提出的，又称为基于序列扩增多态性(Sequence-based amplified polymorphism，SBAP)。2 SRAP的基本原理 通过一对引物对ORFs(open reading frames,开放阅读框架)进行扩增。这一对引物分为正向引物和反向引物。正向引物有17个碱基,5端的前10个碱基是一段填充序列，接着是CCGG特异序列，这
2、14个碱基组成核心序列，随后为3端的选择性碱基，正向引物对外显子进行扩增。5-TGAGTCCAAACCGGATA-3 填充序列 核心序列选择性碱基特异序列 反向引物有18个碱基，5端的前11个碱基是一段填充序列，接着是AATT特异序列，这15个碱基组成核心序列，随后为3端的选择性碱基，反向引物对内含子区域和启动子区域进行扩增。5-GACTGCGTACGAATTGAC-3 填充序列选择性碱基 核心序列特异序列 因内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，从而与正向引物搭配扩增出基于内含子和外显子的SRAP多态性标记。3 SRAP标记的技术流程 3.1 DNA的提取 CTAB法、S
3、DS法等 3.2 SRAP-PCR扩增 n 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6 Mnn 2000bpn 1500bp n n n 500bpn n 100bp n nM：100bp plus DNA ladder marker n图1 Mg2+浓度对SRAP-PCR反应的影响 n M 2.2 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2n2000bpn1500bpn500bpn100bpnM：100bp plus DNA ladder markern图2 dNTPs浓度对SRAP反应的影响n M 3.2 2.7 2.2 1.7 1.2 0.72000bp 1500bp n n500bpn
4、100bp M：100bp plus DNA ladder markern图3 Taq酶浓度对SRAP反应的影响 n M 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 n n2000bp n1500bp n n500bpn n100bp n nM：100bp plus DNA ladder marker n图4引物浓度对SRAP反应的影响 n 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Mn n 2000bp n 1500bpn n n 500bp n n 100bp n nM：100bp plus DNA ladder markern图5模板DNA浓度对SRAP反应的影响SRAP-PC
5、R的反应体系：总体积30ul Mg2+2.4 ul dNTP 0.6 ul F&R 1.5 ul 模板DNA 1.0 ul Taq酶 1.7u 10buffer？ddH2O？SRAP-PCR的反应程序：94 5min 94 1min 35 1min 72 1min 94 1min 50 1min 72 1min 72 10min （杨琦，大白菜SRAP反应体系的建立与优化）5个循环 35个循环3.3 SRAP-PCR扩增产物的分析上样 预电泳 电泳 漂洗胶板 银染 照相 漂洗胶板 显影 漂洗胶板 数据处理 4 SRAP标记的应用 4.1 遗传多样性分析 4.2 遗传图谱的构建 4.3 重要性状
6、的标记 4.4 比较基因组学 4.1 遗传多样性分析 由于在不同的种、不同个体间具有一定的多态性，SRAP技术已成功应用于种质资源的鉴定与评价工作。对同一作物代表性材料用不同的分子标记方法进行遗传多样性分析和形态学分析，在与形态学变异及类型的进化史一致性方面，SRAP标记比AFLP、RAPD等其它方法提供更优良的信息。Ruiz等利用SSR和SRAP两种方法对来自不同地方三个番茄品种进行了遗传多样性及亲缘关系的研究。虽然SSR和SRAP都可以得到结果，但是利用SRAP标记取得的结果分辨率更高些。4.2 遗传图谱的构建 用RAPD标记作图重复性差，一次实验不能得到大量的多态性片段。用AFLP标记作
7、图，可以得到高密度的图，但该技术难度大，费用高。用SRAP标记技术简便、稳定，适用于遗传作图。4.3 重要性状的标记 通过SRAP技术，将一些重要性状标记出来，在以后的新品种选育、性状标记的辅助选择等方面都具有重大的作用。4.4 比较基因组学 研究比较基因组学对研究物种的起源和进化都具有很重要的意义，而转录图谱是进行比较基因组学研究极为有效的手段，利用基于PCR的cDNA-SRAP分析来检测编码区的多态性具有简便、快捷、高效的特点。总之，SRAP标记是一种简单有效的分子标记方法，已用于不同植物、不同的研究目的。SRAP以她简便、中等产量、可显示大量的共显性标记和易于得到测序所需的分离条带、扩增ORFs区域等优点，将在生命科学研究中发挥更大的作用。通过这一节的学习，我们要掌握SRAP标记的原理和技术流程，了解其应用范围。
