1、PCR技术概述授课课件 三篇重要论文 引物引物引物引物1983年 XX DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，缺点：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加入。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍
2、需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的
3、被应用。()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 知知识识点回点回顾顾复温,变34）对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用各种生物标本（如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等）粗制的DNA扩增检测。PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基
4、因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。（5）碱基的随机分布 选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列，这样可以减少引物-引物同源互补的机会。也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡，两个引物的Tm值相差2-3范围内。引物浓度（3）循环参数变性的时间与温度 不同的DNA解链温度不同，由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大，解链温度越高。一般GC含量每增加1%，解链温度就增加0.4。典型的变性条件是95 30s或97 15s。过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。变性温度在90-95 时，既能保证使DNA双链模板变性，
5、又能保持Taq聚合酶活力。因此PCR变性温度在90-95 之间选择，时间为30-60s。退火时间与温度 退火温度决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度。范围一般在25-65，低于引物Tm值5 左右。在典型的引物浓度时，退火时间一般为40-90s，过短会导致引物与模板DNA互补配对失败。延伸时间与温度 延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与浓度，以及延伸温度高低。引物延伸在70-74下进行，根据扩增DNA的长度而确定，一般延伸30-90s。循环次数的确定 以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，PCR的循环次数一般在25-35次。循环系数过多将
6、增加非特异产物；循环次数太少，产率偏低。因此在得到足够产物的条件下应尽量减少循环次数。经典循环参数（500bp以内）30次 催化DNA合成的温度以70-80为宜。高于90时，DNA合成几乎不能进行。（7）其他辅助试剂 加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜）、甘油或甲酰胺等，可提高PCR扩增效率及特征性。可能是消除了引物和模板的二级结构，降低DNA双链的解链温度，使DNA双链完全变性所致。还可加入牛血清白蛋白、明胶、Tween20或二硫苏糖醇（DTT），有助于酶的稳定。在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同
7、.12341234 PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列 对对于未知序列和具有不同末端序列怎么于未知序列和具有不同末端序列怎么办办？（固定化PCR）锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 带有PolyC尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明A-PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。探可用于基因芯片的制作可用于基因芯片
8、的制作 A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达 组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物或基因特异性的引物（GSP）利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能.该技术主要用于:分析基因的转录产物,获取目的基因,合成cDNA探针,构建RNA高效转录系统.RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂杂化双化双链链PCR扩增全新全新4 4通道通道实时荧实时荧光定量光定量PCRPCR仪仪 普通梯度普通梯度PCRPCR仪仪
